多重PCR技术在鸡病毒性传染病诊断中的应用研究进展

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（1.新乡县小冀镇人民政府便民服务中心，河南 新乡 453003；2.河南科技学院）

多重PCR技术在鸡病毒性传染病诊断中的应用研究进展

姬中锋1，李梦丽2，葛亚明2*，赵朴2*

（1.新乡县小冀镇人民政府便民服务中心，河南 新乡 453003；2.河南科技学院）

多重PCR（multiplex PCR，mPCR），是由普通PCR延伸而来的一项PCR技术，在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个目的核酸片段的PCR反应。因其可在单一PCR体系中，同时扩增多个目的片段，多重PCR不仅保留了普通PCR特异性强、灵敏度高的优点，而且具有节约时间、节省人力物力等优点（赵朴等，2014），因此，多重PCR技术已广泛应用于核酸检测的多个领域，包括基因多态性分析、基因突变位点检测、基因缺失分析及病原体核酸检测等。随着规模化养鸡业的快速发展，鸡传染病的发生越来越复杂，混合或继发感染日益多发，特别病毒混合或继发感染更为常见，为方便、快速诊断混合或继发感染，多重PCR技术越来越多地应用于鸡病毒性传染病的诊断中，现就多重PCR在鸡病毒性传染病诊断中的应用研究进展进行综述，以供参考。

1 鸡呼吸道传染病诊断

引起鸡呼吸道传染病的病毒很多，如新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）和传染性支气管炎病毒（IBV）等，而且这些病毒常常混合或继发感染，给养鸡业造成了严重的经济损失，也给兽医临床诊断造成了重要障碍，多重PCR技术的应用有效解决了这一难题。

为有效检测禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒，黄淑坚等（2006）利用分子生物学方法,选择禽流感病毒的M基因、新城疫病毒的F基因以及传染性支气管炎病毒的N基因,分别在基因序列的保守区域设计1对特异性引物,利用所合成的3对引物对相应靶基因进行RT-PCR扩增,建立禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒多联RT-PCR的检测方法，结果表明：这3对引物分别能特异性地扩增出禽流感病毒的M基因片段、新城疫病毒的F基因片段及传染性支气管炎病毒的N基因片段,大小分别为385 bp、520 bp和748 bp。为使检测更加简便，赵建梅等（2003）建立了一步法多重RT-PCR检测新城疫、禽流感、传染性支气管炎病毒。王非等（2007）建立了可同时检测鸡ILV、IBV、NDV和AIV多重RT-PCR，试验结果表明，所设计的4对引物可对同一样品中的ILV、IBV、NDV和AIV进行特异性扩增，所扩增的目的片断的长度分别为620 bp（ILV）、445 bp（IBV）、344 bp（NDV）和240 bp（AIV）；建立的RT-PCR检测方法能够检测出10 pg AIV、1 ng NDV和10 ng IBV的RNA及100 pg ILV的DNA。随后，Rashid等（2009）建立了同时检测的H7、H9和H5 3种常见亚型AIV及NDV、IBV和ILTV3种常见呼吸道病毒的多重PCR，该多重PCR能快速鉴别H7、H9和H5，对于控制疾病AIV在鸡群和人群中传播非常重要，同时该多重PCR能鉴定鸡群混合感染中3种常见呼吸道病毒，因此有助于降低这些病毒造成的经济损失。

多重PCR可有效鉴定病毒亚型。wu等（2013）建立了检测A型流感病毒及H1、H3、H5和H9亚型AIV的多种PCR，A型流感病毒、H1、H3、H5和H9亚型AIV的扩增产物分别为239 bp、612 bp、187 bp、338 bp和289 bp，敏感性和传统PCR敏感性相当，该方法是快速、方便、廉价地大规模筛选临床样品的有效工具。

2 鸡免疫抑制病诊断

免疫抑制病病毒如马立克氏病病毒（MDV）、法氏囊病病毒（IBDV）、白血病病毒（ALV）、传染性贫血病毒（CIAV）、网状内皮增生症病毒REV）、呼肠孤病毒（ARV）等，不仅引起病鸡的死亡、淘汰，而且会引起免疫抑制，导致感染鸡免疫失败，并且免疫抑制病毒常见于混合或继发感染，给养鸡业造成了重要经济损失。多重PCR是检测鸡免疫抑制病毒的有效手段。

为有效检测鸡群中的ARV、REV与ALV，毕研丽等（2012）建立了三重PCR，试验结果表明，该三重PCR方法可对同一样品中的ARV、REV、ALV进行特异性扩增，产物分别为247 bp、675 bp和467 bp，检测敏感性分别为10 pg的ALV、1pg的ARV和10 pg的REV模板。为鉴定ALV的亚群，管宏伟等（2012）建立了能特异性检测禽白血病病毒A、B、J亚群的多重PCR，扩增产物分别为195、260、924 bp，检测的最小拷贝数是103，为禽白血病病毒感染的临床诊断及流行病学调查研究提供了有效手段。

3 小结

鸡病毒性传染病的种类多、传播快、流行广，给国内外养鸡业造成重大的经济损失，特别是伴随养鸡业的规模化和集约化发展，多种病毒引发的混合感染或继发感染在鸡群中越来越常见，给鸡病毒性传染病的临床诊断造成了重要障碍。在普通PCR技术基础上发展起来的多重PCR技术，可同时检测多个病毒，不仅省时省力，节约单个病毒的检测成本，而且可以提高样本的使用率，在鸡病毒性传染病的诊断研究方面取得的重要进展，正如前文所述，在鸡呼吸道传染病、鸡免疫抑制病方面已经建立了有效的多重PCR方法。然而，多重PCR体系中多对引物间的相互干扰和非特异性扩增，限制了多重PCR的敏感性和特异性，为此，已有科研人员开发了新的多重PCR技术，如双启动寡核苷酸引物技术、多重连接依赖式探针扩增技术和靶序列富集多重PCR等，这些技术有效提高了多重PCR的敏感性和特异性。相信，伴随多重PCR技术的不断改进，会有越来越多的多重PCR方法应用于鸡病毒性传染病的诊断研究中，为养鸡业的健康发展保驾护航。□

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：1004-5090（2017）01-0048-02