生物气溶胶核酸检测技术分析

韩丽丽 齐秀丽 徐 莉

(防化学院 北京 102205)

生物气溶胶核酸检测技术分析

韩丽丽 齐秀丽 徐 莉

(防化学院 北京 102205)

生物气溶胶由一些细菌、真菌、病毒等微生物粒子构成,有时又被称为微生物气溶胶。生物气溶胶作为绝大多数生物战剂的施放形式,经常在生物恐怖袭击中扮演重要角色。论文在介绍生物气溶胶定义、来源、特点的基础上,深入分析生物气溶胶核酸检测技术原理、优缺点、装备应用及国内外研究现状,并针对我国生物气溶胶检测技术的研究提出自己的几点建议。

生物气溶胶; 核酸检测技术; 建议

Class Number X831

1 引言

当前,国际战略环境错综复杂,战争的非对称性和作战手段的多样性更加明显,尽管从1972年以来已有162个国家签署了《禁止生物武器公约》,但是不少国家仍在致力于生物武器的研制,造成了一定的生物威胁。2001年的“美国炭疽粉末邮件事件”引起了全球范围内的恐慌,标志着生物恐怖袭击己经成为现实威胁。生物气溶胶作为绝大多数生物战剂的施放形式,经常在生物恐怖袭击中扮演重要角色。如何对生物气溶胶实施快速、准确的检测,已经成为防生物战和反生物恐怖袭击的重要课题。对此,世界各国都越来越重视对生物气溶胶检测技术的研究,以最大限度地杜绝生物恐怖袭击的发生。

2 生物气溶胶概述

2.1 生物气溶胶的定义

具有生命的气溶胶粒子(包括细菌、真菌、病毒等微生物粒子)和活性粒子(花粉、孢子等)以及由有生命活性的机体所释放到空气中的各种质粒被统称为生物气溶胶。由于空气微生物是大气生物气溶胶的主要组成部分,所以生物气溶胶有时又被称为微生物气溶胶,依其种类可划分为细菌气溶胶、真菌气溶胶、病毒气溶胶等。

2.2 生物气溶胶的来源

由于空气中缺少微生物直接可利用的养料,不能繁殖生长,因此空气中无固有的微生物群系,其均由暂时悬浮于空气中的尘埃携带着的微生物所构成,所以大气生物气溶胶主要来源于土壤、灰尘、江河湖海、动物、植物及人类本身。具有较大意义的生物气溶胶的粒径范围是0.1μm～20.0μm。生物气溶胶种类繁多,分布广泛,涉及很多领域,与人类社会的关系较为密切。

2.3 生物气溶胶的特点

体积小且无色无味,从而使得以此为施放形式的生物战剂隐蔽性较强;易渗透,使其对应的生物战剂难于防护,尤其是难于进行物理防护;易扩散,直接喷洒的生物气溶胶可随风飘到较远地区,杀伤范围可达数百至数千平方公里。

3 核酸检测技术

微生物基因组内均含有特异的、有别于其他种或属的核酸序列,这些特征序列相当于微生物的“身份证”或者“指纹”。利用核酸检测技术检测微生物样品中的特征序列及丰度即可实现微生物的鉴别从而进一步检测生物气溶胶。

3.1 核酸杂交技术

核酸杂交技术依据碱基互补配对原理,将带有标志物的核酸探针与被检样品中的目标核酸序列特异性地结合,然后利用特定手段测定标志物,通过确定样品中目标核酸序列的丰度来实现对微生物的鉴别。如果以某种微生物的特征序列为探针,那么通过杂交技术就可以检测样品中是否含有该微生物。核酸杂交技术具有高特异性、高灵敏度的优点,能在几分钟至几小时内检测出pg水平的基因组DNA;利用荧光原位杂交还可以实现目标序列的定位与可视化。

如今,核酸杂交技术已经广泛应用于致病微生物中,以生物气溶胶形式施放的病毒、细菌、立克次体等多种生物战剂都可以被成功检测出来。

3.2 PCR技术

聚合酶链反应(PCR)是一种能在体外快速扩增特定基因片段的方法,即通过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤,对寡核苷酸引物所界定的基因片段进行扩增,通过检测出来的DNA和RNA来实现对微生物的鉴别。Haug-land第一次用PCR技术检测了人工发生真菌Stachybotry chartarum的气溶胶,检测值与直接镜检和已知浓度值相符,证明PCR可以快速定量空气中某种生物气溶胶的浓度。随后他又研究了真菌孢子不同DNA提取方法对PCR技术结果的影响。Cruz-perez研究了应用PCR技术检测环境真菌的引物和探针,并评价了各种DNA纯化方法对PCR技术检测结果的影响。Sou-ichi人为地把炭疽直接加入到空气微生物采样液中,然后用PCR技术进行了分析,结果1个炭疽细胞在1小时内就可检出。Yadav应用PCR技术直接检测工作环境中导致职业病的分枝杆菌和假单孢菌的气溶胶总数,用于对气溶胶暴露的危险评估。Zeng用PCR技术检测了农场环境空气中walleniasebi并与培养计数方法进行了比较,发现PCR技术比培养计数法更灵敏,可以检测出更小浓度的气溶胶。由于生物气溶胶沉降在物体表面可再次形成气溶胶造成二次污染,Buttner研究了生物气溶胶的二次污染对PCR技术的影响以及利用PCR技术检测物体表面消毒前后污染菌的数量以评价消毒措施是否有效。

PCR技术具有特异、快速、灵敏度高并可对初始生物气溶胶浓度进行定量分析,在生物气溶胶的检测中具有很好的应用前景。

如今,PCR技术及其改进技术(如荧光定量PCR技术、多重PCR技术等)已广泛应用于致病微生物的检测与鉴定领域。随着自动化与集成化程度的提高,基于PCR技术的生物战剂检测装备已开始应用于战场。例如,Idah公司研制的耐用型病原菌检测装备能够在30min内实现对炭疽菌、肉毒梭菌、布鲁菌属、沙门菌属和李斯特菌属等的检测,目前已有40多个国家的军队配备了该装备。

3.3 基因芯片技术

基因芯片技术的基本原理是利用核酸探针捕获靶基因来识别生物体的种类。它通过平面微加工技术将大量的核酸探针有规律地排列固定于硅片或玻片等固相支持物上,构成二维探针阵列,用于捕获预先经过荧光物质或核素标记的靶基因,再通过激光共聚焦显微等技术对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测与分析。该技术结合了微电子、微机械、化学合成、光学、计算机等一系列现代科学前沿技术,利用构建的基因芯片及其表面微流分析系统,快速、准确地完成对微生物的鉴定。2005年,Zhou等根据GenBank中SARS-CoV基因组序列,设计了靶向SARS-CoV保守序列的寡核苷酸探针,并将这些探针整合到70-mer基因芯片上,实现了对SARS-CoV的早期检测。通过对临床样品的检测结果表明,基于基因芯片的SARS-CoV早期检测方法特异、有效,对SARS患者的检测敏感性约为91%。2009年,Felder等建立了基于基因芯片技术检测环境样品中炭疽菌的方法,其构建的基因芯片包含靶向炭疽菌质粒毒力基因rpoB以及各亚型炭疽菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌16S rDNA的寡核苷酸探针,并利用该芯片对158份环境样品进行了检测。结果表明:该方法可将炭疽菌与其他杆菌有效区分,整个检测过程仅需12小时。

目前基因芯片已在生物战剂气溶胶检测领域广泛应用。多国权威媒体和刊物中都已有采用基因芯片技术检测大肠埃希菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌、西部马脑炎病毒、出血热病毒等和采用免疫芯片技术检测葡萄球菌肠毒素的研究报道。

但是基因芯片的制作成本还很高,并且需要昂贵的检测仪器,因此该技术主要局限于实验室研究而未能广泛应用于临床致病微生物的检测与鉴定。

3.4 核酸检测技术特点分析

核酸检测技术具有如下优点:和免疫学技术优点相同,该技术具有高特异性、高灵敏度的优点,能在几分钟至几小时内检测出pg水平的基因组DNA。

可是核酸检测技术也有自身的缺陷:该技术本身的专业要求较高,导致形成装备的难度偏大,一定程度上限制了该技术的应用。

3.5 国内外研究现状

早在20世纪90年代初期,西方发达国家便已发明了以PCR技术为代表的核酸检测技术。在随后的20多年里,核酸检测技术以其高特异性、高灵敏度的优点得到广泛关注和良好发展。

汪晓辉等于1996年利用逆转录半套式PCR技术对风疹病毒气溶胶进行检测。但随后,由于各种条件的限制,迟迟未能有创新进展,与西方发达国家的水平差距较大。

4 对我国研究生物气溶胶检测技术的几点建议

通过对生物气溶胶检测技术国内外研究现状的分析,本文认为国内生物气溶胶检测技术与发达国家相比,存在起步较晚、发展较慢、研究较浅、技术较为落后的问题。为提高我国生物气溶胶检测水平,需要做的工作还有很多,本文针对我国实际研究情况,提出以下建议。

4.1 加大对生物气溶胶检测技术的研究力度

我国对生物气溶胶检测技术的研究起步较晚,在人力物力投入方面明显不够,导致一些关键技术较发达国家相比落后较多。而随着生物气溶胶检测技术向自动化、实时化、远程化的趋势发展,其在技术上的要求必定越来越高,这更是需要我国加大对此的研究力度,紧紧追踪国外生物气溶胶检测技术的发展动态和前沿水平,将积极引进先进技术和自主研制有机结合起来,集中力量,联合攻关,以期在不久的将来研究出具有国际先进水平和我军特色的生物气溶胶检测技术。

4.2 重点发展核酸检测技术

检测生物气溶胶的技术很多,遥测技术、免疫学技术、核酸技术、质谱技术、生物发光技术等。每种技术各有优缺点,从目前检测技术发展的现状来看,核酸检测技术在分析时间、灵敏性、可靠性、特异性等方面均优于其他技术,结果如表1所示。

表1 各种检测技术的比较

虽然核酸检测技术有以上多方面的优势,但是其对专业技术的要求较高,一些关键技术尚未得到优化,仍需广大科研人员继续攻坚克难。因此,本文认为我国的研究重点应放在核酸检测技术上,做到优化技术,简化流程,高效地完成对生物气溶胶的检测。

4.3 尝试发展集多种检测技术优点于一身的新型技术

生物气溶胶的检测已经发展为一个涉及多种学科与技术的系统工程,它包括遥测、免疫、核酸、质谱等多种技术。每种技术都含有其特定的优缺点,经研究发现,有时仅靠一种技术很难高效地完成对生物气溶胶的检测。因此,早在20世纪80年代美国等先进国家已开始研究由几种技术、几种仪器组成的JBPDS系统来解决某些复杂的生物气溶胶检测难题。我国应跟随国际先进水平的步伐,尝试发展集多种检测技术优点于一身的新型技术,以期高效的完成对生物气溶胶的检测。

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Analysis of Biological Aerosoldetection Technology

HAN Lili QI Xiuli XU Li

(Institute of Chemical Defence, Beijing 102205)

Biological aerosol is composed of bacteria, fungi and viruses and is sometimes referred to as microbial aerosol. As a releasing form of most biological warfare agents, bioaerosol often plays an important role in the biological terrorist attacks. This paper based on the introduction to the definition, source, and the characteristics of the bioaerosol, summarizes the current biological aerosol detection technology. It also makes a deep analysis on the principles, strengths and weaknesses, the employment of equipment as well as the current research of each technology at home and abroad, and put forward suggestions on the detection of bioaerosol are put forward.

biological aerosol, nucleic acid testing technique, suggestions

2016年8月3日,

2016年9月17日

韩丽丽,女,硕士,讲师,研究方向:生物防护与安全。齐秀丽,女,硕士,副教授,研究方向:生物防护与安全。徐莉,女,博士,副教授,研究方向:生物防护与安全。

X831

10.3969/j.issn.1672-9730.2017.02.005