长链非编码核糖核酸Malat-1、p21和GAS5在大肠癌组织中的表达及其诊断价值

田 智，刘亮华，廖江涛

湖南省人民医院马王堆院区消化内科，长沙 410005

长链非编码核糖核酸Malat-1、p21和GAS5在大肠癌组织中的表达及其诊断价值

田 智，刘亮华，廖江涛△

湖南省人民医院马王堆院区消化内科，长沙 410005

目的 研究长链非编码核糖核酸肺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，Malat-1)、p21和生长停滞特异性转录因子5(growth arrest-specific 5，GAS5)在大肠癌中的表达及诊断价值。方法 选择大肠癌早期和中晚期病变(含癌旁病变)、癌前病变、良性腺瘤和非肿瘤性病变各33例内镜下或手术切除标本，行RT-PCR法检测组织中Malat-1、p21和GAS5的表达水平，ELISA法检测血清癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)和糖链抗原(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)的表达水平。结果 RT-PCR法显示大肠癌早期、中晚期和癌前病变组中Malat-1、p21和GAS5的表达水平显著高于癌旁病变、良性腺瘤和非肿瘤性病变，中晚期组最高(P<0.05)；非肿瘤性病变组的CEA和CA19-9水平显著低于其他组(均P<0.05)，其他5组间比较差异无统计学意义。RT-PCR法检测的Malat-1、p21和GAS5诊断大肠癌的受试者工作曲线(operator characteristic curve，ROC)，分析比较曲线下面积(area under the curve，AUC)，差异无统计学意义(P>0.05)。病理检测结果显示：大肠癌早期、中晚期和癌前病变组各种病理改变显著多于癌旁病变、良性腺瘤和非肿瘤性病变，中晚期组最明显。结论 非编码核糖核酸Malat-1、p21和GAS5在大肠癌不同时期组织中有差异性表达，可作为诊断大肠癌和癌前病变的重要指标。

长链非编码RNA； Malat-1； p21； GAS5； 大肠癌

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)约占98%的基因转录产物，包括微小RNA(micro RNA，miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。microRNA已被证实在多种炎症性疾病、肿瘤性疾病、心脑血管疾病的发病过程中扮演重要角色[1-3]。lncRNA也可以通过多种途径调控基因表达，最近多项研究指出，lncRNA的表达异常可调控细胞的凋亡和自噬机制，在肿瘤增殖、分化和迁移过程中发挥重要作用[4]。大肠癌(colorectal cancer，CC)又称为结直肠癌(colon and rectum carcinoma，CRC)，是一种典型的由基因调控、炎症刺激和免疫紊乱导致的癌前病变进展性疾病，全世界每年新发约120万例，成为第3大恶性肿瘤，患者呈逐年增多且年轻化趋势[5-6]。早期识别高危患者，是提高手术切除率，改善5年生存率的关键[7]。既往研究均指出[8]，作为lncRNA的成员，肺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，Malat-1)、p21和生长停滞特异性转录因子5(growth arrest-specific 5，GAS5)在结直肠癌中可表达升高或降低，结论不一，有可能成为诊断结直肠癌的特异性分子标志物。基于此，本研究拟采用RT-PCR比较不同病变组织中3种分子的表达水平，并采用受试者工作曲线(operator characteristic curve，ROC)分析用lncRNA诊断大肠癌的可行性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

连续选择2015年9月至2016年12月入湖南省肿瘤医院及湘雅三医院、湖南省人民医院(马王堆院区)诊断大肠癌早期和中晚期病变(含癌旁病变，居肿瘤边缘≥5 cm)、癌前病变、良性腺瘤和非肿瘤性病变(Crohn病和溃疡性结肠炎)的病例各33例。

采用染色内镜，或手术切除标本病理诊断大肠的病变，其中染色内镜观察黏膜腺管开口形态判断大肠病变标准：开口为圆形、星芒状或乳头状为非肿瘤性病变；腺管开口为良性腺瘤；开口呈管状、类圆形为癌前病变；分支状、脑回状或沟纹状为大肠癌早期；开口大小不均，排列不规则，甚至消失或无结构为大肠癌中晚期。

各组患者的性别、年龄、肿瘤距肛周距离和最大直径比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

组别男/女年龄(岁)肿瘤距肛周距离(cm)肿瘤最大直径(cm)大肠癌早期组24/952.3±11.46.5±2.35.6±1.4大肠癌中晚期组22/1154.5±13.66.7±2.85.9±1.2癌前病变组20/1353.8±14.46.3±2.25.6±1.7良性腺瘤组21/1255.4±13.36.6±2.35.7±1.4非肿瘤性病变组23/1055.7±15.2--

1.2 主要试剂和仪器

RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司，美国)，DEPC溶液(上海生工生物工程有限公司)，反转录试剂盒(Invitrogen公司，美国)，PCR试剂盒(Invitrogen公司，美国)，RT-PCR荧光定量检测试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，Malat-1、p21和GAS5引物(Invitrogen公司，美国)，癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)和糖链抗原(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)试剂盒(ThermoFisher生物科技公司，美国)；主要仪器：P2型微量加样器(Gilson，法国)，MAX-XP型高速台式离心机(Beackman Coulter Optima，德国)；XSP-63 XA型倒置荧光显微镜(上海杲森设备有限公司)。

1.3 检测方法

1.3.1 RT-PCR法检测组织中Malat-1、p21和GAS5的表达水平 Trizol法提取组织总RNA，ND-2000C微量紫外分光光度计测定总RNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳对RNA进行定量分析。cDNA的合成：EP管中加入总RNA 2 μL、随机引物1 μL、10 mmol/L dNTP混合物2 μL、DEPC水加至12 μL，65℃水浴5 min，冰上静置2 min；依次加入5×反应缓冲液4 μL，MDTT 2 μL，RNA酶抑制剂1 μL；37℃水浴2 min，加入1 μL MMLV逆转录酶，25℃水浴10 min，37℃水浴50 min；70℃水浴15 min终止反应，置于冰上。RT-PCR反应的Malat-1、p21和GAS5引物序列参见表2。

表2 Malat-1、p21和GAS5引物序列Table 2 The primer sequences of Malat-1，p21 and GAS5

反应体系：cDNA模板2 μL，10×扩增缓冲液1 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，10 mmol/L dNTP混合物0.2 μL，10 mmol/L的上下游引物各0.2 μL，双蒸水5 μL，SyberGreen(50×0.1)0.1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/mL)0.1 μL。调整参数：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，70℃ 20 s，40个循环；95℃ 60 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。采集数据Ct值，所有样品Ct值以内参基因标准化后计算样品的相对表达量，采用2-ΔΔCt法：目的基因相对表达量=level目的基因/levelGAPDH=2(CtGAPDH-Ct目的基因)；每次实验每个样本设3个复孔，取其平均值。

1.3.2 ELISA法检测 血清中CEA和CA19-9的表达水平严格按照说明书步骤进行检测。

1.3.3 病理学检查 取各组的组织标本置于10%甲醛溶液中固定、石蜡包埋，苏木精-伊红染色，光镜下观察。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 Malat-1、p21、GAS5和CEA、CA19-9在不同组别的表达比较

大肠癌早期、中晚期和癌前病变组中Malat-1、p21和GAS5表达水平显著高于癌旁病变、良性腺瘤和非肿瘤性病变(均P<0.05)；中晚期组高于早期组，癌前病变组次之，组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)；而癌旁病变、良性腺瘤和非肿瘤性病变比较，差异无统计学意义(P>0.05)。非肿瘤性病变组的CEA和CA19-9水平显著低于其他组(均P<0.05)，而其他5组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

组别Malat-1p21GAS5CEA(ng/mL)CA19-9(U/mL)大肠癌早期组0.4128±0.01690.5682±0.01780.4192±0.01883.6±1.282.8±13.7大肠癌中晚期组0.5647±0.01660.6032±0.01750.4548±0.01823.9±1.487.3±14.2癌前病变组0.3362±0.01770.3495±0.01850.3027±0.01833.6±1.585.4±15.5癌旁病变组0.1320±0.01560.1524±0.01630.1355±0.01643.8±1.482.6±16.2良性腺瘤组0.1276±0.01440.1466±0.01530.1326±0.01593.7±1.378.3±15.7非肿瘤病变组0.1245±0.01520.1488±0.01550.1276±0.01672.6±1.242.5±13.6F4353.9995368.5302472.7864.10542.847P<0.01<0.01<0.010.01<0.01

2.2 Malat-1、p21、GAS5诊断大肠癌的ROC分析

各组大肠组织的Malat-1、p21和GAS5诊断大肠癌的曲线下面积(area under the curve，AUC)相当，敏感度和特异度相似。参见表4和图1。

表4 Malat-1、p21、GAS5诊断大肠癌的ROC分析Table 4 ROC analysis of Malat-1，p21 and GAS5 in diagnosis of colorectal cancer

图1 大肠组织中Malat-1、p21和GAS5表达对诊断大肠癌的ROC分析Fig.1 ROC analysis of Malat-1，p21 and GAS5 in diagnosis of colorectal cancer

2.3 不同组别大肠组织的病理学变化

早期组：杯状细胞减少或坏死，存在不典型增生，大量炎性细胞浸润，基底膜不完整；中晚期组：杯状细胞大量消失，细胞形态不规则，极性破坏，染色质分布不均匀，染色质浓，可见异常分裂，大量炎性细胞浸润，从基底膜浸润到固有层；癌前病变组：增生显著，基底膜不完整，细胞排列不整齐；癌旁病变组：杯状细胞减少，细胞核明显增大，基底膜尚完整；良性腺瘤组：杯状细胞减少，细胞极性稍乱，基底膜完整；非肿瘤病变组：杯状细胞正常，增生不显著，基底膜尚完整。参见图2。

A：早期组；B：中晚期组；C：癌前病变组；D：癌旁病变组；E：良性腺瘤组；F：非肿瘤病变组图2 不同组别大肠组织的病理学变化(苏木精-伊红染色，×200)Fig.2 Pathological changes of colorectal tissue in different groups(HE staining，×200)

3 讨论

在肿瘤研究中，lncRNA Malat-1是首个被发现的与肿瘤转移潜能相关的长链非编码RNA分子，主要存在于细胞核中，在多种人实体肿瘤中异常表达，如乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和肝癌，可能是与肿瘤发生密切相关的长链非编码RNA之一。Malat-1通过调控凋亡基因表达，调节宫颈癌细胞的增殖与侵袭，Malat-1还可影响调控移动性相关的基因增加肺腺癌细胞的转移能力，在肝癌增殖、凋亡和迁移等恶性生物学行为中发挥作用，可作为肝癌移植后肿瘤复发的独立危险因素。本研究结果显示，Malat-1在大肠不同病变中的表达呈现差异性，在中晚期大肠癌、早期大肠癌和癌前病变中表达明显增高，提示Malat-1参与大肠癌的发生发展过程，Malat-1可通过多种机制促进大肠癌的发生[9-13]：①Malat-1与抑癌基因脯氨酸/谷氨酰胺富含性剪接因子(splicing factor proline/glutamine-rich，SFPQ)结合，使原癌基因核糖核酸结合蛋白2(polypyrimidine tract binding protein 2，PTBP2)从SFPQ/PTBP2复合物中释放，PTBP2可发挥促癌作用，加速大肠癌细胞的浸润和转移，同时SFPQ与PTBP2的分离也可促进结直肠癌细胞的增殖和迁移；②Malat-1通过调节丝氨酸/精氨酸剪接因子(Serine/Arginine splicing factor)的磷酸化形式来调节mRNA前体剪接，导致蛋白激酶A锚定蛋白9(A-kinase anchoring protein 9，AKAP9)的高表达，AKAP9具有转移潜能和淋巴结转移的作用，敲除AKAP9的小鼠能阻碍Malat-1介导的大肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭；③Malat-1可分为5个片段，其中6918～8441 nt片段可以增强细胞的增殖和侵袭，片段6918～8441 nt能够加快肿瘤的生长，片段5434～6951 nt突变可促进肠癌的发生。

lncRNA GAS5最初在筛选抑制细胞生长的高表达肿瘤抑制基因时发现，作为细胞周期调节因子，当外界环境营养素缺乏时，机体可反馈性地升高GAS5表达，调节糖皮质激素功能，改变细胞生命活动，使细胞适应缺氧环境，本课题中GAS5在大肠癌组织中表达升高，可能与肿瘤组织本身的低氧微环境有关。研究也显示GAS5高表达与大肠癌的大小、组织学分级和TNM分期密切相关，最近研究表明[14-15]，GAS5在多种肿瘤组织中呈低表达，表现为抑癌基因，过表达GAS5可抑制肿瘤生长、侵袭和转移，并诱导细胞凋亡，增强细胞对化疗药物的敏感性，提示GAS5可作为大肠癌独立预测存活率的重要因子[16-18]，本研究结果也可作为上述结论的佐证。

正常情况下，人体各种细胞均有一定的lncRNA p21蛋白表达，调控细胞基因活动。但在多种恶性肿瘤组织中，p21呈高表达，如大肠癌、乳腺癌和胃癌，p21蛋白表达同大肠癌的分期及淋巴结转移呈正相关，随肿瘤浸润深度增加而增强，与大肠癌的隆起型呈负相关，p21蛋白表达水平越高，患者的预后越差[19-21]。

综上所述，与癌旁病变、良性腺瘤和非肿瘤性病变比较，Malat-1、p21和GAS5三种lncRNA在大肠癌早期、中晚期和癌前病变组均有过度表达现象，但在大肠癌不同阶段及在大肠癌同一阶段的表达也存在不同，在对大肠癌病变的判定同时检测Malat-1、p21和GAS5明显优于单独检测其中一种，因此Malat-1、p21和GAS5具有诊断大肠癌和癌前病变的临床价值。

[1] Bernard D，Prasanth K V，Tripathi V，et al.A long nuclear retained non-coding RNA regulates synaptogenesis by modulating gene expression[J].EMBO J，2010，29(18)：3082-3093.

[2] Xu L M，Chen，L，Li F，et al.Over-expression of the long on-coding RNA HOTTIP inhibits glioma cell growth by BRE[J].J Exp Clin Cancer Res，2016，35(1)：162-163.

[3] Yin X，Zheng S S，Zhang L，et al.Identification of long noncoding RNA expression profile in oxaliplatin-resistant hepatocellular carcinoma cells[J].Gene，2016，596(16)：53-88.

[4] 徐静，徐秋林，郭晓华.长链非编码RNA调控细胞凋亡及自噬的研究进展[J].中国病理生理杂志，2015，31(8)：1525-1530.

[5] Bu D，Yu K，Sun S，et al.NONCODE v3.0：integrative annotation of long noncoding RNAs[J].Nucleic Acids Res，2012，40：D210-D215.

[6] Bohorquez M，Sahasrabudhe R，Criollo A，et al.Clinical manifestations of colorectal cancer patients from alarge multicenter study in Colombia[J].Medicine(Baltimore)，2016，95(40)：e4883-e4888.

[7] Yin D D，He X Z，Zhang E B，et al.Long noncoding RNA GAS5 affects cell proliferation and predicts a poor prognosis in patients with colorectal cancer[J].Med Oncol，2014，31(11)：253-255.

[8] 陈沁楠，王朝霞.长链非编码RNA GAS5在肿瘤研究中的进展[J].现代肿瘤医学，2016，24(1)：138-140.

[9] Fang D，Yang H，Lin J，et al.17β-estradiol regulates cell proliferation，colony formation，migration，invasion and promotes apoptosis by upregulating miR-9 and thus degrades Malat-1 in osteosarcoma cell MG-63 in an estrogen receptor-independent manner[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，457(4)：500-506.

[10] Chen S，Ma P，Zhao Y，et al.Biological function and mechanism of Malat-1 in renal cell carcinoma proliferation and apoptosis：role of the Malat-1-Livin protein interaction[J].J Physiol Sci，2016，Sep 21.[Epub ahead of print]

[11] Wang Y，Xue D，Li Y，et al.The long noncoding RNA Malat-1 is a novel biomarker in various cancers：a meta-analysis based on the GEO database and literature[J].J Cancer，2016，7(8)：991-1001.

[12] Zhou Y，Xu X，Lv H，et al.The long noncoding RNA Malat-1 is highly expressed in ovarian cancer and induces cell growth and migration[J].PLoS One，2016，11(5)：e0155250-e0155255.

[13] Ren D，Li H，Li R，et al.Novel insight into Malat-1 in cancer：Therapeutic targets and clinical applications[J].Oncol Lett，2016，11(3)：1621-1630.

[14] Liang W，Lv T，Shi X，et al.Circulating long noncoding RNA GAS5 is a novel biomarker for the diagnosis of nonsmall cell lung cancer[J].Medicine(Baltimore)，2016，95(37)：e4608-e4612.

[15] Leucci E，Patella F，Waage J，et al.Micro RNA-9 targets the long non-coding RNA Malat1 for degradation in the nucleus[J].Sci Rep，2013，3(8)：2535-2540.

[16] Wang Y N，Shan K，Yao M D，et al.Long noncoding RNA-GAS5：A novel regulator of hypertension-induced vascular remodeling[J].Hypertension，2016，68(3)：736-748.

[17] Chang L，Li C，Lan T，et al.Decreased expression of long non-coding RNA GAS5 indicates a poor prognosis and promotes cell proliferation and invasion in hepatocellular carcinoma by regulating vimentin[J].Mol Med Rep，2016，13(2)：1541-1550.

[18] Cao Q，Wang N，Qi J，et al.Long noncoding RNA GAS5 acts as a tumor suppressor in bladder transitional cell carcinoma via regulation of chemokine(CC motif)ligand 1 expression[J].Mol Med Rep，2016，13(1)：27-34.

[19] Kakeji Y，Mizokami K，Sumiyoshi Y，et al.The prognostic impact of hypoxia-inducible factor-1α and VEGF，IGF-2，p21，p53 expression in gastric adenocarcinoma[J].J Clin Oncol，2009，27(Suppl 15)：4571-4578.

[20] Han D，Zhang X，Zhang J，et al.Oleanolic acid suppresses vascular smooth muscle cell proliferation by increasing lincRNA-p21 expression[J].Oncol Lett，2016，12(5)：3519-3522.

[21] Chillón I，Pyle A M.Inverted repeat Alu elements in the human lincRNA-p21 adopt a conserved secondary structure that regulates RNA function[J].Nucleic Acids Res，2016，44(19)：9462-9471.

(2016-09-01 收稿)

Expression and Diagnostic Values of lncRNA-Malat-1，p21 and GAS5 in Colorectal Cancer Tissue

Tian Zhi，Liu Lianghua，Liao Jiangtao△

DepartmentofGastroenterology，HunanProvincialPeople’sHospital，Changsha410005，China

Objective To study the expression and diagnostic values of long non-coding RNA(lncRNA)metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1(Malat-1)，p21 and growth arrest-specific 5(GAS5)in colorectal cancer tissue.Methods Colorectal cancer of early stage and advanced stage(including paracarcinoma tissue)，precancerous lesion，benign tumor and non-cancer lesion groups were collected，33 cases in each group.The levels of Malat-1，p21 and GAS5 in colorectal tissue of the 6 groups were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).Serum carcinoembryonic antigen(CEA)and carbohydrate antigen19-9(CA19-9)were detected by ELISA.Results RT-PCR showed the levels of Malat-1，p21 and GAS5 were significantly higher in colorectal cancer of early and advanced stage and precancerous lesion than in the paracarcinoma lesion，benign tumor and non-cancer lesion(P<0.05).Malat-1，p21 and GAS5 were the highest in the advanced stage group(P<0.05).The levels of CEA and CA19-9 in non-cancer lesion were the least(P<0.05).The AUC of ROC analysis operator characteristic curve(ROC)of Malat-1，p21 and GAS5 was comparable(P>0.05).Pathological changes showed the pathological changes in colorectal cancer of early stage，advanced stage and precancerous lesion were more significant than those in the paracarcinoma lesion，benign tumor and non-cancer lesion(P<0.05)，which were the most significant in the advanced stage group.Conclusion The levels of Malat-1，p21 and GAS5 in colorectal cancer tissues could be good indicators for colorectal cancer diagnosis.

lncRNA； Malat-1； p21； GAS5； colorectal cancer

田 智，女，1988年生，住院医师，E-mail：327479153@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：jt99399@163.com

R734.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.003