白花蛇舌草通过JAK2/STAT3通路途经诱导膀胱癌T24细胞凋亡

程伟，韩超，范郁会

(西安市高新医院泌尿外科，陕西 西安 710006)

白花蛇舌草通过JAK2/STAT3通路途经诱导膀胱癌T24细胞凋亡

程伟，韩超，范郁会

(西安市高新医院泌尿外科，陕西 西安 710006)

目的研究白花蛇舌草对膀胱癌T24细胞凋亡的影响及其潜在机制。方法MTT法检测不同浓度白花蛇舌草对T24增殖的抑制作用，AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot检测细胞中JAK2、STAT3、Bax、Caspase-3和Bcl-2的表达情况。结果白花蛇舌草明显抑制膀胱癌T24细胞的增殖同时诱导其凋亡，且作用强度随着浓度的增加而增加。Western blot检测证实白花蛇舌草能够显著抑制细胞中JAK2、STAT3和Bcl-2表达，上调Bax和Caspase-3表达。结论白花蛇舌草能够抑制膀胱癌细胞T24增殖，促进其凋亡，可能与抑制JAK2/STAT3通路有关。

白花蛇舌草；膀胱癌细胞；JAK2；STAT3

目前，越来越多的中草药被用于临床各种肿瘤的预防和治疗。作为我国最常见的中药—白花蛇舌草，具有强大的药用价值，例如清热解毒、活血化瘀、利水消肿及抗肿瘤[1]。不少研究已经证实白花蛇舌草能够有效抑制肝癌细胞和乳腺癌细胞增长并且诱导凋亡，但对膀胱癌细胞的作用研究较少[2]。膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的一种恶性肿瘤，并且近年来发病率呈现增高趋势[3]。因此，本研究探索白花蛇舌草对膀胱癌细胞T24增殖和凋亡的影响以及作用机制，为临床膀胱癌的治疗提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 药物和细胞 白花蛇舌草购自福建中医药大学国医堂医院，批号为09072201，人膀胱癌T24细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.2 试剂材料 RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司，MTT试剂盒购自Biosharp公司，Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒购自中国艾美捷科技公司。抗体JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax和Caspase-3均购自美国Cell Signaling公司。

1.3 细胞培养 将人膀胱癌T24细胞接种于RPMI1640培养液中，其中含有10%胎牛血清、100µ/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，常规培养在温度为37°C、5%CO2培养箱中，待细胞生长贴壁时，取对数生长期细胞进行下一步实验。

1.4 MTT法检测白花蛇舌草对T24细胞增殖的影响 将对数生长期的T24细胞浓度调整为1胞浓度5个/mL，吸取200 μL接种于96孔培养板中，当细胞生长贴壁后弃上清液，分别加入质量浓度为1 mg/mL、2 mg/mL和5 mg/mL的白花蛇舌草诱导培养，同时设置空白对照组，不同浓度梯度设置3个复孔。各自培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL MTT，继续共培养4 h，弃掉上清液，每孔加入200 μL DMSO，振荡使其蓝紫色颗粒完全溶解。置于Ascent酶标仪490 nm下检测每孔OD值。

1.5 AnnexinV-FITC/PI染色法检测白花蛇车草对T24细胞凋亡的影响 收集空白对照组细胞和不同浓度的药物组(1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL)培养24 h后细胞，室温条件下以2 000 r/min进行离心10 min，弃去上清液，用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，再次进行2 000 r/min离心10 min，洗涤细胞，加入300 μL Binging Buffer悬浮，加入5 μLAnnexinV-FITC混匀，室温孵育15 min，上机前5 min，加入5 μL PI以及200 μL的AnnexinV-FITC，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。

1.6 Western blot检测各组细胞JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax和Caspase-3表达 分别加入蛋白裂解液置于各组已经收集的细胞，提取其蛋白含量并进行定量分析。每个样品孔加入25 μg蛋白，各组细胞蛋白进行SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上，37°C下进行1%BSA封闭1 h，依次加入1:1 000稀释的JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax和Caspase-3多克隆抗体，加辣根过氧化物酶标记二抗，37℃温度下反应1 h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝胶成像系统依次显影、定影，Quantity One Basic软件分析蛋白条带。

1.7 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，多组间计量数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间比较采用最小显著差法(least significant difference，LSD)，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 白花蛇舌草对T24细胞增殖的抑制作用 与空白对照组比较，不同浓度的白花蛇舌草预处理均能够减少T24细胞在各个时间点的OD值，并且呈现浓度依赖性关系，组间差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 不同浓度白花蛇舌草对T24细胞OD值的影响(±s)

表1 不同浓度白花蛇舌草对T24细胞OD值的影响(±s)

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与1 mg/mL白花蛇舌草比较，bP＜0.05；与1 mg/mL白花蛇舌草比较，cP＜0.05。

组别24 h 48 h 72 h空白对照组1 mg/mL白花蛇舌草2 mg/mL白花蛇舌草5 mg/mL白花蛇舌草F值P值0.150+0.008 0.135+0.007a0.124+0.008ab0.109+0.008abc137.000 0.000 0.258+0.007 0.241+0.010a0.220+0.009ab0.208+0.007abc196.000 0.000 0.364+0.012 0.341+0.008a0.320+0.009ab0.304+0.011abc265.000 0.000

2.2 白花蛇舌草对T24细胞凋亡的促进作用 相比于空白对照组，不同浓度的白花蛇舌草预处理均能增加T24细胞的凋亡，并且呈现浓度依赖性关系，组间差异有统计学意义(F=189.247，P＜0.05)，见图1。

2.3 白花蛇舌草对凋亡相关蛋白表达的影响 相比于空白对照组，不同浓度的白花蛇舌草预处理均能够抑制Bcl-2表达，上调Bax和Caspase-3表达，并且呈现浓度依赖性关系，各组Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相对表达比较分析得知F值分别为268.457、138.492和164.159，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

2.4 白花蛇舌草对JAK2/STAT3信号通路的影响 相比于空白对照组，不同浓度的白花蛇车草预处理均能够抑制JAK2和STAT3表达，并且呈现浓度依赖性关系，各组JAK2和STAT3蛋白相对表达比较分析得知F值分别为284.164和361.178，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

图1 白花蛇舌草对T24细胞凋亡的影响

图2 白花蛇舌草对T24细胞凋亡相关蛋白表达的影响

图3 白花蛇舌草对T24细胞JAK2/STAT3相关蛋白表达的影响

3 讨 论

膀胱癌是一种最常见的泌尿系统恶性肿瘤，复发性强的同时治疗费用高，给人们的生活带来巨大的经济负担，已经成为世界范围内的公众健康问题[4-6]。白花蛇舌草是一种常用的抗肿瘤中药，临床上已经证实白花蛇舌草对胃癌、肺癌、淋巴癌、肝癌以及妇科肿瘤具有较好的疗效，但是其作用机制尚不明确[7-10]。本研究探讨了白花蛇舌草对膀胱癌细胞体外增殖和凋亡的影响以及作用机制。

本研究中，不同浓度白花蛇舌草处理膀胱癌T24细胞，MTT结果显示不同浓度白花蛇舌草均能够抑制T24细胞增殖，并且呈现浓度依赖性关系。流式细胞术检测对其细胞凋亡的影响，结果表明浓度越高对膀胱癌细胞T24的凋亡作用具有更强的诱导作用。因此，笔者可以推断白花蛇舌草能够抑制膀胱癌细胞增殖并且诱导凋亡。

研究表明，恶性肿瘤的发生常常与细胞周期调控失常有密切关系。本研究中分析了白花蛇车草对膀胱癌细胞中凋亡相关蛋白表达的影响。Western blot结果显示不同浓度白花蛇舌草均能够上调Bax和Caspase-3的表达，抑制Bcl-2蛋白表达。JAKs家族和STATs家族广泛分布于各种组织和细胞中，JAK-STATs信号通路调控着细胞增殖、分化和凋亡等重要途径，该通路的异常激活能够导致细胞的过度增殖和恶性转化。本研究在探索白花蛇舌草对膀胱癌细胞增殖凋亡作用机制的时候，采用Western blot分析细胞经过不同浓度白花蛇舌草处理后JAK2和STAT3的表达情况。很明显，不同浓度白花蛇舌草能够显著抑制细胞内JAK2和STAT3的表达，并且呈现剂量依赖性关系。因此，我们推断白花蛇舌草抑制膀胱癌细胞的增殖以及诱导其凋亡可能与抑制其JAK2/STAT3信号通路有关。

综上所述，白花蛇舌草能够有效抑制膀胱癌细胞的增殖，诱导其凋亡，这可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关，这为临床治疗膀胱癌提供了理论基础。

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Herba Hedyotis Diffusae induces human bladder cancer T24 cells apoptosis through inhibiting JAK2/STAT3 signaling pathways.

CHENG Wei,HAN Chao,FAN Yu-hui.Department of Urological Surgery,Xi'an Gaoxin Hospital, Xi'an 710006,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Herba Hedyotis Diffusae on human bladder cancer cells T24 cells apoptosis and its possible molecular mechanism.MethodsAfter treated with different concentrations of Herba Hedyotis Diffusae,MTT assay was used to detect the inhibitory effect of Herba Hedyotis Diffusae on proliferation of T24 cells.AnnexinV-FITC/PI double labeled flow cytometry was used to detect the apoptosis rate.The expression of janus kinase 2(JAK2),signal transducer and activator of transcription 3(STAT3),Bax,Caspase-3,Bcl-2 in cells were detected by Western blot.ResultsHerba Hedyotis Diffusae significantly inhibited the T24 cells proliferation and induced apoptosis in a dose-dependent manner.Western blot results showed that Herba Hedyotis Diffusae significantly inhibited the expression of JAK2,STAT3 and Bcl-2,and up-regulated Bax and Caspase-3 expression.ConclusionHerba Hedyotis Diffusae could inhibite proliferation of bladder cancer T24 cells and induce apoptosis,and the mechanism maybe through inhibiting the JAK2/STAT3 signaling pathways.

Herba Hedyotis Diffusae;Bladder cancer cells;Janus kinase 2(JAK2);Signal transducer and activator of transcription 3(STAT3)

R737.14

A

1003—6350(2017）01—0014—03

2016-07-08)

韩超。E-mail：331226224@qq.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.004