脂氧素 A4对缺氧状态下人肝癌细胞增殖的影响

苗 烁，王素梅，程 雪，李尧丰，马明洋，李 钢，吴 萍

脂氧素 A4对缺氧状态下人肝癌细胞增殖的影响

苗 烁，王素梅，程 雪，李尧丰，马明洋，李 钢，吴 萍

目的探讨缺氧环境下脂氧素 A4(lipoxin A4，LXA4) 对肝癌细胞增殖的影响。方法采用小鼠肝癌细胞 H22 接种构建小鼠肝癌皮下移植瘤模型，观察 LXA4对肿瘤生长的影响。 采用免疫组织化学法检测细胞增殖核抗原 Ki-67 和缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α) 表达。 四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞增殖水平。结果在接种肝癌细胞 H22 的 7～ 15 d，小鼠皮下可见清晰肿瘤包块生长；在各相应时间点，给予 LXA4的小鼠肿瘤体积均明显缩小(P＜0.05)，同时明显降低了肿瘤组织内部 Ki-67 和 HIF-1α 表达。 体外培养发现 200 nmol/L LXA4可明显抑制缺氧条件下人肝癌细胞 HepG2 的增殖。结论LXA4能抑制缺氧条件下肝癌细胞的增殖。

脂氧素 A4；肝细胞癌；缺氧；增殖

肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC) 是全球范围内最常见的肿瘤之一，也是病死率第 3的恶性肿瘤[1]。 我国是 HCC 的高发地区，新增和死亡HCC 病例约占全世界的 50%[2]。 目前，外科手术切除仍是 HCC 首选的治疗方法，遗憾的是 HCC 起病隐匿、病情进展迅速，大多数患者确诊时已处于中晚期，不适宜手术，且对常规化疗药物不敏感。

由于氧气的弥散距离仅为 100 μm，快速增长的肿瘤组织往往处于氧供不足的状态，这使得缺氧成为实体肿瘤的重要特征之一[3]。 肿瘤细胞对低氧的适应性变化是其得以生存的关键，同时缺氧对肿瘤组织的增殖、侵袭、转移、血管生成等各方面也起到了调控作用[4]。

以往的实验发现，机体重要的促炎症缓解介质——脂氧素 A4(lipoxin A4，LXA4) 的结构类似物能抑制肝癌细胞 H22 皮下移植肝癌小鼠的肿瘤生长、血管内皮生长因子的表达以及血管的新生[5]。为进一步探讨 LXA4对缺氧状态下肝癌细胞增殖的影响，本研究采用整体模型和缺氧培养的人肝癌细胞 HepG2，观察 LXA4对肝癌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性清洁级 BALB/c 小鼠 24 只，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供[SCXK-(鄂)-2016-0009]，5 ～ 6 周龄，18 ～ 22 g，置于室温分笼饲养，均自由进食、饮水，光照明暗交替 12 h/d。 所有动物实验操作均严格遵守华中科技大学同济医学院实验动物伦理委员会的相关规定。

1.1.2 细胞 小鼠肝癌细胞 H22 和人肝癌细胞HepG2 购自中国典型培养物保藏中心。

1.1.3 主要试剂 达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium， DMEM) 高 糖培养基(美国 HyClone 公司)；胎牛血清(杭州四季青公司) ；抗生素(100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素)、二甲基亚砜、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、四甲基偶氮唑盐比色[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， MTT] 及 羟 基 荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂( 美国 Sigma 公司)；LXA4(美国 Cayman 公司)；兔抗人 /小鼠细胞增殖核抗原 Ki-67 抗体( 美国 Santa Cruz 公司) ；兔抗人 /小鼠缺 氧 诱 导 因 子-1α (hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)抗体、小鼠抗人 β-actin 抗体、辣根过氧化物酶标志山羊抗兔/小鼠 IgG(美国 Abcam 公司)；信使RNA(messenge RNA，mRNA) 引物(上海生物工程有限公司) ；2 × 聚 合 酶 链 反 应 (polymerase chain reaction，PCR) 混合液( 美国 Invitrogen 公司) ；第一链互补 DNA 合成试剂盒(日本 TOYOBO 公司)；总蛋白提取试剂盒( 加拿大 Fermentas 公司) ；二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA) 蛋白分析试剂盒及电化学发光(electrochemical luminescence，ECL) 试剂盒( 美国 Pierce 公司) ；蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)凝胶试剂盒(美国 Bio-Rad 公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝癌皮下移植瘤模型的建立和分组按照本课题组已建立 的 方 法[5]， 将 腹水中生长 7 d的 H22 细胞置于磷酸盐缓冲溶液 (phosphate buffer saline，PBS) 中，取 0.2 mL 悬液(1×106/mL) 接种于BALB/c 小鼠的右腋皮下，隔天测量小鼠肿瘤大小，14 d 后取肿瘤组织。 24 只小鼠随机分为模型组和给药组，给药组隔天腹腔注射溶于 10%乙醇中的LXA4(1 μg/kg) ，模型组给予等量的 10%乙醇。

1.2.2 肿瘤大小测量 每日用游标卡尺测量肿瘤最大长径(long diameter，L) 及宽径(width diameter，W)，计算肿瘤体积(volume，V)[5]，V(mm)=LW2/2。

1.2.3 免疫组织化学检测 HIF-1α 分离的肿瘤组织进行 10%甲醛固定、石蜡包埋切片。 然后常规脱蜡至水，0.3%H2O2室温孵育 10 min，再于微波抗原修复液中进行微波修复 20 min，滴加正常山羊血清封闭液、室温 20 min。 1 ∶500 稀释的抗 HIF-1α 和 1 ∶1 000稀释的抗 Ki-67 一抗，4 ℃ 过夜，PBS 洗 2 次，每次 5 min； 滴 加 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 志 的 二 抗 30 μL，室温静置 1 h，PBS 洗 2 次，每次 5 min；滴加链霉亲和素-过氧化物酶，室温 37 ℃ 孵育 30 min，PBS洗 2次，二氨基联苯胺显色。 阳性表达为细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒。 采用半定量结果判断，每张切片随机观察5个高倍镜视野，分别对细胞进行染色强度和百分比给予评分，阳性细胞百分比＜5%为 0 分、5%～25%为 1 分、26%～50%为 2 分、51% ～75%为 3 分、＞75%为 4 分，阳性着色强度无色为 0分、淡黄色为 1 分、棕黄色为 2 分、棕褐色为 3 分，将阳性细胞百分比与阳性着色强度相乘为等级即0分为阴性(-)、1～4 分为弱阳性(＋)、5～8 分为阳性(＋＋)、9～12 分为强阳性(＋＋＋)。

1.2.4 细胞培养 将人肝癌细胞 HepG2 置于含10%胎牛血清和 1%青霉素-链霉素混合液的 DMEM高糖培养基中，然后在 37 ℃、5%CO2培养箱中，每隔 24 ～ 48 h 定期观察细胞状态并换液，必要时以 1∶2 或 1∶3 比例传代，以维持细胞的良好生长状态。细胞置于 1%O2、94%N2及 5%CO2混合缺氧气体中培养。

1.2.5 MTT 法检测细胞增殖能力 收集对数期HepG2 细胞，于 96 孔板中每孔加入 100 μL 含细胞培养基，使细胞密度为 5×103个/孔；贴壁后换用无血清培养基，继续培养 24 h，然后置于缺氧培养箱，分为对照组(1%O2) 和 LXA4处理组(1%O2＋200 nmol/L LXA4)， 每组、 每 个时 间 点 各 5 孔， 分 别 于24、48、72 h 停止实验。 弃去培养液，用 PBS 洗 2遍。 每孔加入 90 μL DMEM 和 10 μL MTT 溶液，使其终质量浓度为 0.5 mg/mL，培养 4 h；弃上清，每孔加入 75 μL 二甲基亚砜，低速振摇 10 ～ 15 min 使结晶物充分溶解。 测量各孔的光密度值(492 nm)。

1.3 统计学处理 应用 Graphpad Prism 软件，肿瘤大小及细胞增殖率以均数±标准差表示，2 组间均数采用 t检验；免疫组织化学评分以中位数±标准差表示，2 组间均数采用 Wilcoxon 秩和检验，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荷瘤小鼠的皮下肿瘤生长 在接种 H22 细胞的 7 ～ 15 d，小鼠皮下可见清晰肿瘤包块生长，边界清晰；在各相应时间点，LXA4给药组的 V 均明显小于对照组(P＜0.05，图 1)。

图1 荷瘤小鼠的皮下肿瘤生长

2.2 荷瘤小鼠肝癌组织内 Ki-67 及 HIF-1α 的表达镜下观察可见模型组肿瘤组织内 Ki-67 和 HIF-1a均呈强阳性，给药组小鼠肿瘤组织表达均下降。 Ki-67 在模型组和给药组的评分分别为(6±1.9)分和(4±2.2) 分，差异有统计学意义(P=0.027 6) ；HIF-1α在模型组和给药组的评分分别为(6±1.9) 和(4± 1.7) ，差异有统计学意义(P=0.008 5)。 见图 2。

图2 荷瘤小鼠皮下肿瘤组织Ki-67 及 HIF-1α 表达

2.3 HepG2 细胞增殖情况 HepG2 细胞在缺氧条件下增殖率明显降低(P＜0.05，图 3)。

图 3 HepG2 细胞增殖

3 讨论

自 1863 年最初观察到肿瘤组织周围存在炎性细胞浸润，其后大量证据无不提示肿瘤与炎症息息相关[6]。 LX 是花生四烯酸经过脂加氧酶代谢途径的产物，为体内最重要的抗炎及促炎症消退脂质，被称为“炎症刹车信号”，已被证实与多种疾病的发生密切相关，如风湿性关节炎、哮喘、休克、糖尿病等[7]。 其在肿瘤中的作用引起了越来越多研究人员的重视，如:能触发肿瘤相关巨噬细胞从 M2 型转向 M1 型，从而导致肿瘤细胞的凋亡，减慢其发展[8]；介导了南美响尾蛇神经毒素对大鼠乳腺癌移植瘤模型肿瘤生长和血管新生的抑制作用[9]；减弱了胰腺癌细胞的侵袭能力[10]；以往也证实其在离体水平能促进肝癌细胞的凋亡[11]。

LX 受体激动剂 BML-111 是经化学方法合成的LXA4结构类似物，能通过与 LXA4受体结合而模拟其促进炎症缓解的效应，在动物肝损伤、关节炎和肺损伤模型 中均 发挥 保护 作用[12-15]。 本实 验发 现其能抑制小鼠肝癌在移植部位的肿瘤生长、减少其内部血管新生，并显著抑制肿瘤在肺部的转移[5]。 由于 BML-111 并非体内存在的天然化合物，且仅能与LXA4的几种受体之一结合，其与内源性 LXA4的作用仍然存在一定差距。 本实验中，首先采用隔天腹腔注射 LXA4的方法，证实 LXA4具有抑制小鼠肝癌生长的作用，比以往仅注射 BML-111 能更直接、真实地反映体内 LXA4对肝癌生长的影响作用。 当然，本实验中采用的腹腔注射 LXA4的方法，虽是目前用于小鼠整体实验的常用给药手段，但检测其最终到达肿瘤局部的浓度仍然值得进一步探讨。

缺氧是包括肝癌在内的实体瘤的重要内环境特点和固有特征之一[3，16]，那么 LXA4对肝癌的抑制作用与缺氧是否相关呢?HIF-1 是细胞应对缺氧反应的中心环节，其由 HIF-1α 和 HIF-1β 2 个亚基组成，前者在细胞缺氧时含量增高，从转录水平调节多种靶基因的表达，激活多种缺氧相关的信号通路[17]。 本实验中，通过免疫组织化学法，观察到皮下移植瘤组织中 HIF-1α 呈明显高表达，而 LXA4给药组的含量明显下降。 HIF-1α 是诱导缺氧状态下血管新生的重要因子之一，而新生的血管又为肿瘤的生长提供了有利条件[18]。 结合以往发现的 BML-111 能减少移植瘤模型中血管的新生的现象[5]，可以证实 LXA4对 HIF-1α 通路的抑制作用。

目前，有关缺氧对肿瘤细胞生长状态的影响存在不同的结论，虽然大多数细胞在缺氧条件下生长减慢，但是肿瘤的特殊生物学特征，使其对缺氧微环境更容易适应和生存，甚至生长加快[19-20]。 本实验同时检测了 HIF-1α 和反应细胞增殖指标 Ki-67 的含量，结果可见两者在模型组肿瘤中均明显高表达，而给药组则均显著下降。 为进一步观察 LXA4的作用，将 HepG2 细胞置于 1%的 O2中培养，MTT 法检测结果可见缺氧 24 ～ 72 h，细胞数目增加，而 LXA4处理组细胞相对单纯缺氧对照组增殖率明显下降。离体水平的实验更进一步证实了 LXA4对缺氧状态下肝癌细胞增殖的抑制作用。

总而言之，在本课题组以往证实 BML-1111 能抑制肝癌内部血管生长的基础上，在整体和离体水平证实 LXA4对缺氧状态下的肝癌细胞增殖具有抑制作用。

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The effect of lipoxin A4on the proliferation of human hepatocellular carcinoma under hypoxia

MIAO Shuo1， WANG Sumei1， CHENG Xue1， LI Yaofeng1， MA Mingyang2， LI Gang3， WU Ping1
(1.Department of Pathophysiology， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430030， China； 2.Hepatic Surgery Center， Tongji Hospital of Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology， Wuhan Hubei 430030， China； 3.Department of Surgery，Liyuan Hospital， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan Hubei 430077， China)

ObjectiveTo explore the effect of lipoxin A4(LXA4)on the proliferation of human hepatocellular carcinoma(HCC)under hypoxic condition.MethodsEctopic HCC mice model was established by injection H22 cells subcutaneously.Immunohistochemistry assay was applied to detect the protein expression of Ki-67 and hypoxia-inducible factor-1 α (HIF-1α).HepG2 cells were cultured under 1%O2to establish a hypoxic condition.3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)assay was used to measure cell proliferation rate.ResultsIn 7 to 15 days after H22 cell transplantation，the subcutaneous tumor in mice could be observed.At all the time points， the tumor volume of LXA4mice was significantly reduced(P ＜ 0.05).At the same time， LXA4significantly decreased the expression of Ki-67 and HIF-1α inside tumor tissue.In vitro study showed that 200 nmol/L LXA4obviously inhibited HepG2 proliferation under 1%O2.ConclusionLXA4could inhibit the HCC growth under hypoxia.

Lipoxin A4(LXA4) ； Hepatocellular carcinoma(HCC) ； Hypoxia； Proliferation

R735.7；R349.89

A

2095-3097(2017)01-0016-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.004

2017-01-09 本文编辑:徐海琴)

国家自然科学基金面上项目(81272313)

430030，湖北 武汉，华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系(苗 烁，王素梅，程 雪，李尧丰，吴 萍)；430030，湖北 武汉，华中科技大学附属同济医院肝脏外科中心(马明洋)；430077，湖北 武汉，华中科技大学同济医学院附属梨园医院外科(李 钢)

李 钢，E-mail:wpingwp＠mails.tjmu.edu.cn

[注 明] 苗 烁，王素梅:为共同第一作者