应用二代测序技术招测罕见病的遗传学研究

张宁 孙艳美 罗艳 王方娜 张明明 王莉 高健 李亚丽

·病例报告·

应用二代测序技术招测罕见病的遗传学研究

张宁 孙艳美 罗艳 王方娜 张明明 王莉 高健 李亚丽

二代测序;基因突变;NTRK1基因;BTK基因

罕见病目前国际上对其没有统一的标准，一般指临床发病率低，较少见的疾病。罕见病在欧洲定义是发病率lt;1/2 000的，在美国指患病人数lt;20万的疾病，而中华医学会遗传学分会2010年将那些患病率lt;1/500 000或新生儿lt;1/10 000发病率的疾病定义为罕见病[1-3]。二代测序技术能够平行对多个靶基因进行测序，目前开始逐渐应用在在符合孟德尔遗传罕见病的研究[4,5]。本研究应用二代测序法对2例临床罕见病患者进行基因筛查，以期明确病因。

1 临床资料

1.1 病例1：女，32岁。因“幼时2次骨折、无痛无汗”欲生育而进行遗传咨询。自幼时起患者就从未感知到过疼痛和外界的温度，幼时有过2次骨折，当时均未有任何疼痛感觉，从未有出汗情况，经常发生高热，伴有肌张力减退。其余外观和智力发育等均未见异常。家族中无相同或相似患者。现与一正常男性结婚，准备生育，担心生育与其相同孩子，前来咨询，要求查找病因。结合临床考虑先天性无痛无汗症或成骨发育不全，进行相关基因的二代测序，结果发现由NTRK1基因突变引起，患者NTRK1基因中存在c.287+2dupT杂合突变和c.851-33Tgt;A杂合突变，从而明确诊断为先天性无痛无汗症。

1.2 病例2：男，5岁，因“反复发热感染”要求查找病因而就诊。患儿生后7个月即因肺炎感染住院治疗，之后反复发热感冒，淋巴结肿大，3年前出麻疹，4个月前起皮肤瘙痒严重，2个月因发热、流涕腹痛住院，辅助检查：免疫球蛋白-A(IgA)0.09 g/L(正常值0.34～1.38 g/L)，免疫球蛋白-G 4.910.09 g/L(正常值5.0～10.6 g/L)，免疫球蛋白-M 0.02 g/L(正常值0.44～1.44 g/L)，总T细胞91.7%(正常值60%～82%)，抑制性T细胞45.3%(正常值20%～35%)，总B细胞0.3%(正常值5%～18%)。患儿父母同龄身体均健康，25岁足月顺产此患儿，为第一次孕产，生后评分正常。无家族史。患儿父母为避免再次生育此类患儿，前来就诊要求查找患儿发病机制。结合患儿临床，进行免疫缺陷病相关基因的二代测序，实验结果发现患儿BTK基因c1573Ggt;A位点发生突变，明确诊断X-连锁无丙种球蛋白血症Ⅰ型。

2 讨论

先天性无痛无汗症(CIPA)是一种遗传方式为常染色体隐性遗传病的罕见病。通常临床表现全身无汗、对疼痛和温度没有感觉。由于对疼痛和温度无感知，故容易受到反复严重的外伤；无法出汗，经常会引起高热和热性惊厥的发作。目前CIPA发病机制尚不明了，有研究认为神经营养因子酪氨酸激酶受体 1 型 (NTRK1)基因突变可引起本病[6]。NTRK1是神经生长因子的高亲和力受体，一旦发生NTRK1 基因突变不仅能影响 NTRK1和 NGF 的结合，也可引起细胞内结构参与信号转导的阻滞[7]。本研究中的患者的NTRK1基因c.287+2dupT杂合突变和c.851-33Tgt;A杂合突变，均为HGMD报道的已知致病性突变。CIPA属于临床罕见病，很多临床医师对CIPA认识往往不足，多数就诊原因为高热或者骨折，容易造成误诊、漏诊，因此加强对该病的认识，早期诊断，早期干预，才能最大程度避免不必要的伤害。

X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)是一种罕见的X染色体隐性方式遗传的免疫缺陷疾病，均为男性发病。一般认为B细胞浆内 Bruton 酪氨酸激酶(BTK)基因发生突变导致 B 细胞分化受阻，从而外周血中成熟 B 细胞含量极低，血液中无丙种球蛋白，造成机体免疫力低下，故主要临床症状是反复细菌感染，如复发性中耳炎和呼吸道、肠道、皮肤感染等[8]。关节炎可见于10%～30%的XLA患者，通常表现单一大关节炎，多关节炎非常罕见，目前仅有5例报道。通常XLA都是点突变引起，近来Sharma等[9]报道了1例2757个碱基的大缺失，外显子8、9、10均缺失，这比较罕见。一般生后6个月后，在母源性免疫抗体小时候，患儿即开始反复感染。目前研究发现XLA 致病基因所编码的蛋白属于酪氨酸激酶家族，称为 BTK，任何位点的 BTK 基因发生突变均能使其功能障碍，造成 B 细胞的分化过程阻滞，外周血中成熟 B 细胞因而减少[10]。本研究中患儿自七个月起即反复呼吸道感染，皮肤反复感染致使其上下肢上满布皮疹，实验结果发现患儿BTK基因c1573Ggt;A位点发生突变，Sanger测序验证患儿母亲携带BTK基因c1573Ggt;A(p.R525X)杂合突变。其母再次生育若为男胎，机会为1/2，需行产前诊断。

随着现代科技的发展，医学领域中测序技术已经被广泛应用，二代测序技术(又称为下一代测序技术)的应用是人类基因测序史上的一次划时代的革命。二代测序技术采用了边合成边测序法，在Sanger等测序方法的基础上，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，具有通量高、耗时短、成本低的特点，目前已经成为基础和临床医学中的一项重要研究技术，正逐渐应用于罕见病、肿瘤等复杂性多种疾病的病因筛查和临床诊疗工作中[11]。本研究中的2例患者正是通过二代测序技术筛查出致病基因，明确了临床诊断和遗传方式，为出生缺陷评估提供了依据。相信通过二代测序技术，大量以前不能明确病因的罕见病会被临床医学所认识。

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5 Yang Y,Muzny DM,Xia F,et al.Molecular findings among patients referred for clinical whole-exome sequencing.JAMA,2014,312:1870-1879.

6 Li M，Liang JY，Sun ZH，et al．Novel nonsense and frameshift NTRK1 gene mutations in Chinese patients with congenital insensitivity to pain with anhidrosis.Genet Mol Res,2012,11:2156-2162．

7 Beigelman A，Levy J，Hadad N，et al.Abnormal neutrophil chemotactic activity in children with congenital insensitivity to pain with anhidrosis (CIPA):the role of nerve growth factor.Clin Immunol,2009,130:365-372．

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.24.051

项目来源：河北省科学技术研究与发展计划项目(编号：17277728D)；河北省医学科学研究重点课题(编号：20160464)

050051 石家庄市，河北省人民医院生殖遗传科(张宁、孙艳美、罗艳、王方娜、高健、李亚丽)，检验科(张明明)，产科(王莉)

李亚丽，050051 石家庄市，河北省人民医院生殖遗传科；E-mail:lyl8703@sina.com

R 394.33

A

1002-7386(2017)24-3839-02

2017-07-03)