晚期氧化蛋白终产物对破骨细胞分化的影响

庄景燊 朱思远 黄玉圣 徐 平 陈建庭 钟招明

(南方医科大学南方医院脊柱骨科，广东 广州 510515)

·基础研究·

晚期氧化蛋白终产物对破骨细胞分化的影响

庄景燊 朱思远 黄玉圣 徐 平 陈建庭 钟招明

(南方医科大学南方医院脊柱骨科，广东 广州 510515)

目的 探讨晚期氧化蛋白终产物(AOPPs)对破骨细胞分化的影响。方法 体外分离培养大鼠骨髓单核细胞，分为空白对照组、阴性对照组(RSA)、AOPPs组、阳性对照组(RANKL)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制剂组(AOPPs+夹竹桃麻素)，干预6 d后，通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察TRAP阳性多核细胞，鬼笔环肽荧光染色观察F肌动蛋白(F-actin)环，甲苯胺蓝染色观察骨磨片的骨吸收陷窝。此外，AOPPs刺激2 h后，通过DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)生成。结果 AOPPs 及阳性对照组RANKL 均可诱导TRAP阳性多核细胞、F-actin环及骨吸收陷窝形成，并且AOPPs刺激后细胞ROS生成明显增多。AOPPs所致以上效应均能被NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素阻断。结论 AOPPs可诱导大鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化。

晚期氧化蛋白终产物；骨髓单核细胞；破骨细胞；分化

晚期氧化蛋白终产物(AOPPs)是体内蛋白质在氧化应激状态下生成的一类双酪氨酸蛋白质交联物〔1〕，不但是氧化应激的重要标志物，而且参与多种疾病的发生发展〔2，3〕。前期研究发现，绝经后骨质疏松患者体内AOPPs升高，血清AOPPs蓄积水平与腰椎骨密度呈负相关关系〔4〕；大鼠体内 AOPPs 蓄积水平与增龄性骨量丢失呈负相关关系〔5〕；AOPPs体内干预可加速老龄大鼠骨量丢失、骨微结构退化，增强氧化应激水平〔6〕；AOPPs体外干预可抑制成骨样细胞增殖、降低成骨分化活性〔7〕。这些研究表明AOPPs可能是一类新的致病介质，参与骨质疏松的发生发展。破骨细胞分化增加及骨吸收功能增强，易导致骨量丢失增加、加速骨代谢失衡。本研究拟通过体外分离培养大鼠骨髓单核细胞，并用AOPPs刺激，观察AOPPs对其向破骨细胞分化的影响，以期进一步阐明AOPPs在骨质疏松中的致病机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 大鼠血清白蛋白(RSA，Sigma)；次氯酸钠(分析纯,PanEra LifeScience)；冰醋酸(分析纯，天津富宇精细化工有限公司)；氯胺-T(Sigma);2',7'-二氢二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA荧光探针，Sigma)；重组大鼠RANKL蛋白(RANKL，Abcam)；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,PeproTech)；胎牛血清(FBS，Sigma)；夹竹桃麻素(Apocynin，Sigma)；大鼠淋巴细胞分离液(Panera)；骨磨片(南方医院骨与软骨再生医学实验室馈赠)；激光共聚焦显微镜(日本欧林巴斯光学工业株式会社，FV10i)；酶标仪(美国MDS公司，M5)；倒置显微镜(德国Leica仪器股份有限公司，DM IL LED)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓单核细胞培养 取雄性4周龄SD大鼠，无菌条件下取出大鼠双侧股骨和胫骨；超净台中剔除骨组织周围的软组织，剪开干骺端，用5 ml无菌注射器抽取无血清α-MEM培养液反复柔冲骨髓腔4次，收集冲洗液以450 r/min离心15 min，弃上清，以80% 标准FBS α-MEM培养液悬浮沉淀，制成细胞浓度为 2×108～1×109/ml的单细胞悬液备用。先加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液，用移液枪小心吸取骨髓单细胞悬液样本加于分离液液面上，注意保持二者分界液面平稳，450 r/min离心25 min。离心后，用移液枪小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15 ml离心管中，向离心管中加入10 ml清洗液，轻柔混匀，250 r/min离心10 min。弃上清，重复清洗步骤2次。用含体积分数10%FBS、50 ng/ml M-CSF 的α-MEM培养液10 ml重悬单核细胞后接种于100 mm培养皿。

1.2.2 骨髓单核细胞鉴定 接种后3 d的原代骨髓单核细胞用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化下来，计数调整细胞密度为106个/ml，离心以去除培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2次后加入100 μl PBS重悬，并标记为1、2管。1管为阴性对照，2管加入2 μl CD14直标荧光抗体，冰上静置反应30 min。离心后加入PBS清洗1次，每管加入400 μl的2%多聚甲醛，转移到流式管后上机检测。

1.2.3 AOPPs体外制备 根据前期报道的体外制备AOPPs的方法〔8〕，将RSA(20 mg/ml)与40 mmol/L的次氯酸等体积混合，室温下放置反应30 min，制备出来的RSA与次氯酸摩尔比为1/70。制备的AOPPs在无内毒素PBS 中透析24 h，以除去游离的次氯酸。用 0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存。20 mg/ml RSA与PBS等体积混合，作为对照组。采用氯胺-T法测量制备的AOPPs浓度：AOPPs与PBS按1∶5稀释，氯胺-T同法稀释RSA与PBS混合物作空白对照，加入1.16 mmol/L碘化钾(KI)10 ml及乙酸20 ml后立刻在340 nm处检测吸收值，AOPPs浓度以氯胺-T含量表示(μg/ml)。

1.2.4 细胞干预条件 为了观察AOPPs诱导破骨细胞分化的作用，取对数生长期骨髓单核细胞接种于96孔板中，4 000个细胞/孔。过夜预培养(37℃、5%CO2)后，分别设置为空白对照组，RSA组(100 μg/ml)，阳性对照组(RANKL，50 ng/ml)，AOPPs刺激组(100 μg/ml)，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制剂组(AOPPs 100 μg/ml+夹竹桃麻素100 μmol/L)，每组设置3个复孔。每2 d换一次液，持续诱导6 d。

为了观察AOPPs对细胞内活性氧(ROS)生成的影响，取对数生长期骨髓单核细胞接种于96孔板中，4 000个细胞/孔。过夜预培养(37℃、5%CO2)后，分别设置空白对照组、RSA组(100 μg/ml)、AOPPs 50 μg/ml刺激组、AOPPs 100 μg/ml刺激组、AOPPs 150 μg/ml刺激组、NADPH氧化酶抑制剂组(AOPPs 100 μg/ml +夹竹桃麻素100 μmol/L)，每组设置3个复孔，刺激2 h后测量ROS生成。

1.2.5 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 TRAP是破骨细胞的特异性标志酶，TRAP染色是鉴定破骨细胞的常用方法之一〔8〕。TRAP染色液的配制：取0.5 ml快速石榴石型碱溶液与0.5 ml亚硝酸盐溶液，轻轻混匀30 s，室温静置2 min。取预热(37℃)去离子水45 ml，分别加入上述混合溶液，0.5 ml萘酚 AS-BI磷酸溶液(Naphthol AS-BI Phosphate Solution)，2.0 ml醋酸盐溶液，1.0 ml酒石酸盐溶液混合备用。

骨髓单核细胞被诱导6 d后，细胞经PBS洗3次，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，弃多聚甲醛，预热(37℃)去离子水洗细胞3遍。将配制好的TRAP染液加入细胞中，水浴(37℃)避光孵育60 min，去离子水彻底清洗后苏木素复染2 min，碱性自来水冲洗至出现蓝色的细胞核。TRAP染色阳性多核细胞为胞质呈大量酒红色颗粒，细胞大小不一，有许多细长的伪足样突起，细胞形态呈油煎蛋形等多边形，胞核多，细胞核>3个为破骨细胞。

1.2.6 罗丹明-鬼笔环肽荧光染色 F肌动蛋白(F-actin)环形成是成熟破骨细胞被激活发挥骨吸收功能的标志，罗丹明-鬼笔环肽荧光染色是判断F-actin环形成的有效方法〔8〕。

取对数生长期骨髓单核细胞4×105个/皿接种于共聚焦皿中，诱导6 d后，弃培养基，预温(37℃)PBS清洗细胞2次，5 min/次，4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS清洗3次、10 min/次。5%Triton室温透膜5 min，PBS清洗3次，10 min/次后每皿加入500 μl罗丹明-鬼笔环肽(Rhodamine Phalloidin) 室温避光孵育30 min，PBS清洗3次，5 min/次。加500 μl DAPI染液染色10 min，PBS清洗3次，5 min/次，激光共聚焦显微镜观察。

1.2.7 骨吸收染色 取对数生长期的骨髓单核细胞以4×104个/孔接种于预置骨磨片的48孔板中，过夜预培养(37℃、5%CO2)，待细胞贴壁后，设置空白对照组，RSA组(100 μg/ml)，阳性对照组(RANKL，50 ng/ml)，AOPPs刺激组(100 μg/ml)，NADPH氧化酶抑制剂组(AOPPs 100 μg/ml+夹竹桃麻素100 μmol/L)，每组设置3个复孔。诱导6 d后取出各组骨磨片，0.25%氢氧化铵超声5 min/次×3次，经梯度酒精(40%，70%，80%，90%，100%)脱水后自然晾干，预热56℃ 0.5%甲苯胺蓝染色10 min，去离子水清洗后光学显微镜下观察骨吸收陷窝。

1.2.8 ROS生成检测 取对数生长期骨髓单核细胞以4 000个/孔接种于96孔板中，过夜预培养(37℃、5%CO2)，待细胞贴壁后，分别设置空白对照组、RSA组(100 μg/ml)、AOPPs 50 μg/ml刺激组、AOPPs 100 μg/ml刺激组、AOPPs 150 μg/ml刺激组、NADPH氧化酶抑制剂组(AOPPs 100 μg/ml +夹竹桃麻素100 μmol/L)，预培养2 h，PBS轻柔彻底清洗细胞以除去牛血清，加入DCFH-DA荧光探针，37℃孵育30 min，用PBS清洗2次，荧光酶标仪激发光为488 nm，吸收光为525 nm检测。

取对数生长期的骨髓单核细胞以4×105个/皿接种于共聚焦皿中，过夜预培养(37℃、5%CO2)，待细胞贴壁后，分别加入完全培养基，完全培养基+RSA，完全培养基+AOPPs，完全培养基+AOPPs+夹竹桃麻素，预培养2 h，PBS轻柔彻底清洗细胞以除去牛血清，加入DCFH-DA荧光探针，37℃30 min，用PBS清洗2次，激光共聚焦显微镜观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析和LSD法检验。

2 结 果

2.1 骨髓单核细胞鉴定 CD14阳性细胞即为大鼠骨髓单核细胞，约占检测细胞的50%。

2.2 AOPPs 诱导TRAP染色阳性多核细胞形成 诱导6 d后的骨髓单核细胞经TRAP染色，倒置显微镜观察，AOPPs组及RANKL阳性对照组均见TRAP染色阳性多核细胞形成，而空白对照组、RSA组及AOPPs +夹竹桃麻素组未见TRAP染色阳性多核细胞形成。见图1。

2.3 AOPPs 诱导 F-actin环形成 诱导6 d后的骨髓单核细胞行罗丹明-鬼笔环肽荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，AOPPs组及RANKL阳性对照组均见呈圆形或类圆形的F-actin环形成，而空白对照组、RSA组、AOPPs +夹竹桃麻素组中未见明显的F-actin环。见图2。

2.4 AOPPs增加骨吸收陷窝形成 骨吸收实验表明，诱导6 d后，甲苯胺蓝染色示RANKL组及AOPPs组的骨磨片上出现类圆形蓝色骨吸收陷窝。相比之下，空白对照组、RSA组、AOPPs +夹竹桃麻素组中的骨磨片则无明显骨吸收陷窝形成。见图3。

图1 AOPPs 诱导骨髓单核细胞向TRAP阳性多核细胞形成

图2 AOPPs 诱导F-actin环形成(箭头标示)

图3 AOPPs增加骨吸收陷窝形成

2.5 AOPPs 增加ROS生成 予 50、100、150 μg/ml AOPPs 刺激骨髓单核细胞，显示随着剂量浓度的增加,细胞 ROS 的生成逐渐增加〔分别为(251.58±43.89)%，(297.35±4.59)%，(284.41±19.99)%〕,其中 100 μg/ml AOPP 产生的 ROS 浓度最高，且各浓度组与对照组〔(97.47±9.31)%〕之间差异显著，加入夹竹桃麻素可明显抑制 AOPPs诱导的 ROS 生成〔(112.64±16.52)%〕(P<0.05)。

在共聚焦显微镜中观察AOPP 刺激骨髓单核细胞产生ROS量的变化，细胞质中可见到绿色的荧光颗粒，即为ROS的表达，荧光强度越强，表明胞内ROS表达越高。与空白对照组、RSA组相比，AOPPs组的荧光强度明显较强，而夹竹桃麻素能有效地抑制AOPPs导致的这一效应。见图4。

图4 激光共聚焦分析AOPPs对骨髓单核细胞内ROS生成的影响(×10)

3 讨 论

AOPPs是体内蛋白质氧化修饰损伤的产物，也是氧化应激的重要标志物。在慢性肾脏疾病、肥胖、糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征等慢性疾病患者中，血清AOPPs水平升高〔9〕。研究证实AOPPs能激活细胞内NADPH氧化酶，促使ROS生成，激活敏感的信号通道(如MAPK，NF-kappa B)，上调肿瘤坏死因子(TNF)-α 等炎症因子表达〔10～13〕。因此，AOPPs是一类新型的致病介质，可通过诱发氧化应激参与多种疾病的病理过程。

骨质疏松是以骨量减少、骨的微结构退变为特征，导致骨脆性增加容易发生骨折的全身性骨病〔14〕。在病理条件下，骨吸收超过骨形成，骨代谢失去平衡，发生骨质疏松。破骨细胞作为骨吸收的主要细胞，对于骨量的变化具重要作用〔15〕。破骨前体细胞的分化成熟和成熟破骨细胞的活化是骨吸收作用的前提，破骨细胞分化研究对骨质疏松的机制探讨及其防治具有重要意义。前期研究证实AOPPs与骨质疏松存在相关性，并且可抑制成骨样细胞增殖、降低成骨分化活性〔4～7〕，但是 AOPPs是否参与调控破骨细胞分化及活性尚不清楚。TRAP 为破骨细胞特异性的标志酶，在成熟破骨细胞和融合前单核细胞内表达，在破骨细胞前体细胞内不表达。既往研究证实RANKL是破骨细胞分化的重要调节因子，可诱导破骨前体细胞(如骨髓单核细胞，外周血单核细胞，RAW264.7 细胞)向TRAP染色阳性细胞分化，即诱导破骨细胞形成〔16〕。本研究结果表明AOPPs可诱导破骨细胞分化。

破骨细胞进行骨吸收时，形成一个富含F-actin环的缝合区锚定在骨质上，分泌质子和蛋白酶，溶解和降解骨基质〔17〕。因此，F-actin环形成是成熟破骨细胞被激活后发挥骨吸收活性的标志。F-actin环可以通过罗丹明-鬼笔环肽荧光染色显示出来〔8〕。已证实AOPPs干预骨髓单核细胞可诱导F-actin环形成，这一效应与阳性对照RANKL组类似，而空白对照组及阴性对照组未发现F-actin环形成。为了进一步验证AOPPs诱导破骨细胞分化及骨吸收活性，本研究检测AOPPs诱导骨髓单核细胞向破骨细胞分化后骨吸收作用，实验结果表明AOPPs能促进破骨细胞骨吸收功能，这一作用与RANKL组效应类似。因此，AOPPs可诱导骨髓单核细胞向破骨细胞分化成熟，并发挥骨吸收功能。

NADPH 氧化酶表达于大多数细胞，包括破骨前体细胞以及破骨细胞，是细胞内 ROS 产生的主要途径之一〔18〕。NADPH氧化酶介导产生的ROS为破骨细胞分化过程必需的信号分子。本研究发现，AOPPs可促进骨髓单核细胞内产生大量的ROS，NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素显著降低AOPPs诱导的ROS生成，说明NADPH氧化酶在该效应中发挥重要作用。夹竹桃麻素也能抑制AOPPs诱导的TRAP阳性细胞及F-actin环形成。以上实验结果均表明，NADPH氧化酶介导产生的ROS可能在AOPPs诱导骨髓单核细胞向破骨细胞分化成熟中发挥重要作用。总之，AOPPs作为一类新型的致病介质，能促进骨髓单核细胞内ROS生成，诱导破骨细胞分化成熟，发挥骨吸收功能。这些发现为探索骨质疏松的发生、发展机制提供了新的思路。

1 Witko-Sarsat V,Nguyen-Khoa T,Jungers P,etal.Advanced oxidation protein products as a novel molecular basis of oxidative stress in uraemia〔J〕.Nephrol Dial Transplant,1999;14(1):76-8.

2 Yavuzer S,Yavuzer H,Cengiz M,etal.The role of protein oxidation and DNA damage in elderly hypertension〔J〕.Aging Clin Exp Res,2016;28(4):625-32.

3 Komosinska-Vassev K,Olczyk P,Winsz-Szczotka K,etal.Age-and gender-related alteration in plasma advanced oxidation protein products (AOPP) and glycosaminoglycan(GAG) concentrations in physiological ageing〔J〕.Clin Chem Lab Med,2012;50(3):557-63.

4 Wu Q,Zhong ZM,Pan Y,etal.Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in postmenopausal osteoporosis〔J〕.Med Sci Monit,2015;21:2428-32.

5 Zhang YB,Zhong ZM,Hou G,etal.Involvement of oxidative stress in age-related bone loss〔J〕.J Surg Res,2011;169(1):e37-e42.

6 曾纪焕，钟招明，肖 强，等.晚期氧化蛋白质终产物对老年大鼠骨密度和骨微结构的影响〔J〕.中国骨质疏松杂志,2015;25(11):1313-7.

7 Zhong ZM,Bai L,Chen JT.Advanced oxidation protein products inhibit proliferation and differentiation of rat osteoblast-like cells via NF-kappaB pathway〔J〕.Cell Physiol Biochem,2009;24(1-2):105-14.

8 Ferlin A,Pepe A,Facciolli A,etal.Relaxin stimulates osteoclast differentiation and activation〔J〕.Bone,2010;46(2):504-13.

9 Passali D,Corallo G,Yaremchuk S,etal.Oxidative stress in patients with obstructive sleep apnoea syndrome〔J〕.Acta Otorhinolaryngol Ital,2015;35(6):420-5.

10 Witko-Sarsat V,Gausson V,Nguyen AT,etal.AOPP-induced activation of human neutrophil and monocyte oxidative metabolism:a potential target for N-acetylcysteine treatment in dialysis patients〔J〕.Kidney Int,2003;64(1):82-91.

11 Witko-Sarsat V,Friedlander M,Nguyen-Khoa,etal.Advanced oxidation protein products as novel mediators of inflammation and monocyte activation in chronic renal failure〔J〕.J Immunol,1998;161(5):2524-32.

12 Zheng S,Zhong ZM,Qin S,etal.Advanced oxidation protein products induce inflammatory response in fibroblast-like synoviocytes through NADPH oxidase-dependent activation of NF-kappaB〔J〕.Cell Physiol Biochem,2013;32(4):972-85.

13 Ye W,Zhong Z,Zhu S,etal.Advanced oxidation protein products induce catabolic effect through oxidant-dependent activation of NF-kappa B pathway in human chondrocyte〔J〕.Int Immunopharmacol,2016;39:149-57.

14 Silverman S.Individualizing osteoporosis medications〔J〕.Menopause,2014;21(3):306-8.

15 Teitelbaum SL.Bone resorption by osteoclasts〔J〕.Science,2000;289(5484):1504-8.

16 赵玉鸣,葛立宏,等.小鼠骨髓细胞和脾细胞诱导形成破骨细胞潜能的比较〔J〕.现代口腔医学杂志,2006;20(1):49-51.

17 Manolagas SC.Birth and death of bone cells:basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis〔J〕.Endocr Rev,2000;21(2):115-37.

18 Sasaki H,Yamamoto H,Tominaga K,etal.Receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand-induced mouse osteoclast differentiation is associated with switching between NADPH oxidase homologues〔J〕.Free Radic Biol Med,2009;47(2):189-99.

〔2016-03-25修回〕

(编辑 袁左鸣)

Advanced oxidation protein products induced the osteoclast differentiation of rat bone marrow mononuclear cells in vitro

ZHUANG Jing-Shen，ZHU Si-Yuan，HUANG Yu-Sheng，etal.

Department of Orthopedic and Spinal Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, China

Objective To evaluate the effect of advanced oxidation protein products (AOPPs) on osteoclast differentiation in vitro.Methods Rat bone marrow mononuclear cells were isolated and cultured in vitro, and divided into the blank control，negative control(RSA), positive control(RANKL), AOPPs, NADPH oxidase inhibitor groups (AOPPs+ Apocynin). After treatment for 6 days, the TRAP-positive multinuclear cells were observed by using tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining，the F-actin ring by phalloidine fluorescence staining，the bone resorption pits on bone slices by toluidine blue. Furthermore, intracellular reactive oxygen species (ROS) generation were detected by DCFH-DA fluorescent probe after AOPPs stimulation for 2 hours.Results The TRAP-positive multinuclear cells, F-actin ring and bone resorption pits on bone slices were observed in AOPPs and RANKL positive control groups. Meanwhile, AOPPs stimulation increased ROS generation. However,the above effects of AOPPs challenge were abolished by the apocynin, a NADPH oxidase inhibitor.Conclusions AOPPs could induce the osteoclast differentiation of rat bone marrow mononuclear cells in vitro, which provides a new sight in understanding the pathogenic basis of osteoporosis.

Advanced oxidation protein products; Bone marrow mononuclear cells; Osteocalst; Differentiation

国家自然科学基金项目(No.81000785,81472135)

钟招明(1946-)，男，副教授，硕士生导师，主要从事骨质疏松研究。

庄景燊(1994-)，男，硕士，主要从事骨质疏松研究。

R681

A

1005-9202(2017)03-0521-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.001