新疆杨树叶纹斑病病原菌分离及致病性测定

张金萍+蒋萍

摘要：2014—2015年通过实地考察、采集病叶标本并采用常规的组织分离方法对病叶中的病原菌进行分离，对分离物培养纯化，并观察其形态特征，为确定这些分离物是否为杨树叶纹斑病的致病菌，根据柯赫氏法则进行分离物的致病性测定及再分离试验。结果表明，相同症状的病叶可以分离出多个不同的菌株，由于不同菌株的致病性强弱不一，使得在不同的接种条件下，不同菌株对健康杨树叶片的致病性差异显著，潜育期及发病率均不相同，根据ArcGIS软件对病叶进行分级，统计病情指数，并进行LSD检验，判断出强致病菌。通过再分离试验得到原致病菌，在显微镜下对强致病菌进行形态学鉴定，初步判定为链格孢属（Alternaria sp.）真菌。

关键词：杨树叶纹斑病；病原菌分离；致病性测定；链格孢属

中图分类号： S763.15 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0110-04

杨树是杨柳科杨属（Populus L.）落叶乔木的通称，全属共有100多个品种，其中有50多种分布在我国，主要栽种于我国西部各省。在北疆的额尔齐斯河流域、南疆的塔里木河流域以及天山南北坡的河谷中分布着大面积的杨树原始林[1-2]，杨树也是新疆地区绿化造林的重要树种之一。国内外报道的有关杨树叶部坏死斑类的病害主要有褐斑病（Marssonina brunnea）[3]（别称黑斑病）、灰斑病（Coryenum populinum）、皱叶病（Eriophyes dispar）[4]、角斑病（Cercospora populina）[5]、叶缘枯病（Macrophama sp.）[6]、花叶病（CMV）、黑星病（Fusicladium tremulae）、叶枯病（Alternaria alternata）[7]、斑枯病（Septoria）等，其中叶枯病别称叶纹斑病（Alternaria）[8-9]。徐素琴等1984年对黑龙江省森林植物园、辽宁省盖县杨树研究所的病叶中的病原菌进行分离培养、鉴定，确定病原菌为细极链格孢（Alternaria tenuis），但未作病原菌的致病性测定[10]。1979年赵震宇首次报道了新疆杨树叶纹斑病的病原菌为细链格孢菌，但未对病原菌进行分离及致病性测定[11]。黄毅2010年对采自东北林业大学林场的杨树叶枯病病样中的病原菌也进行了分离培养、鉴定，确定病原菌为[A. alternate （Fr.） Keissl]，但未作病原菌的致病性测定[5]。因此，本研究通过对新疆杨树叶纹斑病病叶中的病原菌分离培养、纯化及致病性测定，為进一步对杨树叶纹斑病的病原菌进行鉴定及确认其分类地位提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

杨树病叶于2014年5月至2015年9月采自乌鲁木齐市、石河子市、沙雅县、阿拉尔市、玛纳斯县等地区。

1.2 病原菌分离培养

采用组织分离法[12]，取病健交界处组织，切成0.5 cm×0.5 cm的小块，放入无菌的烧杯中，用0.1%氯化汞溶液消毒60 s，然后用无菌水漂洗3次，最后用无菌滤纸吸去多余的水分，将病块组织移入PDA培养基平板上，每皿放5块，3次重复，以健康叶片组织作对照，放入25 ℃光照恒温培养箱中培养，3 d后挑取菌落边缘菌丝进行纯化。分离率=病原菌菌落数/分离组织块总数×100%。

1.3 致病性测定

1.3.1 接种菌株 根据菌株的菌落特征，从乌鲁木齐市分离菌株中选3个菌株、阿拉尔市选2个菌株、玛纳斯县选2个菌株、石河子市选3个菌株、沙雅县选2个菌株，共选取12个菌株。

1.3.2 接种材料 离体叶片：从活体树上摘下健康的杨树叶片。活体树：田间健康杨树。

1.3.3 接种体 菌饼：在纯化7 d后的菌落上，打取直径为 6 mm 的菌饼作为接种体。

孢子悬浮液的制备：将菌饼接种到PDA液体培养基（100 mL/瓶）中，每个菌株接种3瓶，共接种36瓶。置于 28 ℃ 恒温箱中振荡培养7 d后，用磁力搅拌机搅拌3 min制成孢子悬浮液。

1.3.4 接种方法 将叶片用流水冲洗，再用70%乙醇表面消毒，自然晾干，备用。接种方法分为刺伤和无伤接种，刺伤接种时先用无菌针在叶片接种部位刺伤4个点，将直径为 6 mm 的菌饼的菌丝面贴于伤口上，对照接空白培养基块。孢子悬浮液接种用同样的刺伤方法，将配制好的孢子悬浮液喷洒在刺伤叶片的正反两面，对照喷洒无菌水。无伤接种时直接将菌饼贴在叶片接种部位上，对照接空白培养基块。无伤孢子悬浮液接种即将配制好的孢子悬浮液喷洒在健康叶片的正反两面，对照喷洒无菌水。各接种处理均重复3次，接种后喷无菌水保湿48 h，定期观察并记录发病情况，计算发病率。发病率= 发病点数/接种总点数×100%。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离结果

2014—2015年对不同地区的病叶进行5次常规组织分离[11]，共分离268块组织（表1），其中真菌菌落232个，占总数的86.6%；根据真菌菌落的颜色、形态特征及生长速度的差异性[13]共分为5类菌株，将菌株在PDA平板上纯化3 d后，可以观察到菌落形态特征的差异性。如图1所示，第1类菌株表面呈灰白色的绒毛状，菌落疏松；第2类菌株表面呈灰色棉絮状，较为蓬松；第3类菌株表面呈深褐色的绒毛状，菌落较为紧密；第4类菌株表面呈紫红色且有较长的绒毛覆盖，菌落疏松；第5类菌株表面呈粉红色且有较短的绒毛，菌落紧密。

2.2 分离物致病性测定结果

2.2.1 室内离体材料接种 由表2可知，健康的杨树叶片接种12个真菌（表3）后，用菌饼接种的杨树叶片发病速度最快，潜育期最短，其中杨树叶片接种菌株M1、M2、M3、M11后发病率均达到100%，接种菌株M4、M8后发病率均为91.7%，接种菌株M6、M9后杨树叶片的发病率均为83.3%。剩余菌株致病性较弱，在相同的接种时间内，潜育期较长，发病率较低。用孢子悬浮液接种后，对照均不发病，杨树叶片接种菌株M1、M2、M4、M11后发病率均大于50.0%。