TLR4、CD14在干燥综合征患者唇腺组织中的表达及临床意义

张东霞　项德坤　郭伟民

【摘要】 目的：探讨干燥综合征患者唇腺组织分泌功能损伤与TLR4、CD14的关系。方法：通过对干燥综合征患者唇腺组织进行免疫组化和逆转录聚合酶链式反应，来检测其中TLR4、CD14蛋白和mRNA的表达。结果：（1）TLR4和CD14在干燥综合征组唇腺组织中表达明显增高，对照组唇腺组织中未见TLR4、CD14表达；（2）按照病理分级，TLR4、CD14表达的阳性率分别为0～1级62.5%，2级70.0%，3级75.0%，4级58.3%，各组间TLR4、CD14表达阳性率差异均有统计学意义（P<0.05）；（3）约64.4% PSS唇腺组织导管上皮细胞有TLR4、CD14的表达，在淋巴细胞灶中67.8%的淋巴细胞表达TLR4、CD14，但差异无统计学意义（P>0.05）；（4）TLR4、CD14 mRNA在干燥综合征组唇腺组织中的表达明显高于对照组（P<0.05）。结论：TLR4、CD14在干燥综合征唇腺组织中高表达，干燥综合征唇腺组织分泌功能的损伤，可能与外源性感染启动TLR4、CD14信号传导通路有关；在干燥综合征发病机制中，导管上皮细胞主动参与了免疫损伤过程。

【关键词】 TLR4； CD14； 唇腺组织

Expression and Clinical Significance of TLR4，CD14 in Patients with Sjogrens Syndrome Labial Gland Tissue/ZHANG Dong-xia，XIANG De-kun，GUO Wei-min.//Medical Innovation of China，2016，13（35）：051-055

【Abstract】 Objective：To study the relationship between TLR4，CD14 and patients with sjogrens syndrome labial gland secretion tissue damage and.Method：Through the labial gland tissue in patients with sjogren's syndrome immunohisto chemical and reverse transcription polymerase chain reaction，to detect the TLR4，CD14 protein and mRNA expression.Result：（1）CD14 and TLR4 expression in labial gland organization in sjogren's syndrome group was obviously higher，the control group did not see labial gland tissue TLR4，CD14 expression.（2）According to the pathological classification，TLR4，CD14 expression positive rate respectively 0-l level was 62.5%，2 level was 70.0% and 3 level was 75.0% and 4 level was 58.3%.TLR4，CD14 expression positive rate differences were statistically significant（P<0.05）.（3）About 64.4% of PSS labial gland duct epithelial cells had the expression of TLR4，CD14，about 67.8% of the lymphatic in focal lymphocytic cells express TLR4，CD14，there was no statistically significant difference（P>0.05）.（4）TLR4，CD14 mRNA expression of labial gland tissue in sjogrens syndrome group was obviously higher than that of the control group（P<0.05）.Conclusion：TLR4，CD14 in sjogrens syndrome labial gland tissue increases，sjogrens syndrome labial gland secretion of tissue damage，may exogenous infection start TLR4 and CD14 signaling pathways.Epithelial cells in the pathogenesis of sjogrens syndrome，actively involve in the immune damage process.

【Key words】 TLR4； CD14； Salivary gland

First-authors address：The PLA 285th Hospital，Handan 036000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.35.013

干燥綜合征（sjogrens syndrome，SS）是风湿免疫病中的常见疾病，其病理特点为淋巴细胞浸润人体外分泌腺所形成的一种慢性炎症反应[1]，其可能的病因与遗传、免疫、内分泌和感染等因素有关[2]。其中细菌感染与自身免疫性疾病的关系目前受到广泛重视，研究表明干燥综合征患者合并牙周炎的概率很高，而导致牙周炎的常见细菌是革兰阴性菌（gramnegative bacteria，GNB）[3]。现已知，当人体感染GNB后，其菌体本身和/或其内毒素——脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）随之进入血循环，激活淋巴细胞等炎性细胞，释放多种炎性介质，最终导致免疫炎症发生[4]。TLR4（Toll like receptor 4）、CD14是人体对LPS产生免疫应答的主要受体，LPS可以通过TLR4、CD14信号传导系统启动固有免疫和自身免疫，从而导致自身免疫性疾病的发生[4]。那么，SS的发病与该信号传导系统是否有关，为此设计本课题旨在探讨细菌感染在SS发病中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 唇腺组织中TLR4、CD14 mRNA检测样本采集与分组 经解放军第285医院伦理委员会批准并逐一签署患者知情同意书后，选择解放军第285医院风湿科门诊或住院患者中因病情需要需做唇腺活检者48例，进行唇腺组织样本采集，经临床分析，其中符合干燥综合征分类标准的患者27例，作为干燥综合征组；通过血清学检查和唇腺组织活检否定干燥综合征诊断的患者21例，作为对照组进行唇腺组织中TLR4、CD14 mRNA的检测。

1.1.2 唇腺组织中TLR4、CD14蛋白检测样本采集与分组 采用解放军第285医院2011年2月-2016年

2月常规石蜡包埋的唇腺组织标本作为研究对象，根据患者的病历资料，其中诊断符合干燥综合征分类标准的唇腺标本作为研究组，共31例，其中男3例，女28例；临床排除干燥综合征诊断的标本作为对照组，共20例，其中男3例，女17例。

1.1.3 唇腺标本采集 在无菌条件下，手术切取患者唇腺组织约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小2小块，一块常规病理检查，另一块即刻置于Trizol液中，10 min内置-70 ℃冰箱保存，备RNA提取用。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器及试剂 Mx3005荧光实时定量PCR仪（美国Stratagenes公司）、PTC-100 PCR仪（美国MJ Research公司）、鼠抗任CD14单克隆抗体（北京中杉金桥公司）、Trizol总RNA提取试剂盒（大连宝生物公司）、兔抗人TLR4单克隆抗体 （博士德公司）、引物由上海生物工程有限公司合成、DNA Marker（北京博迈德公司）、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（大连宝生物公司）。

1.2.2 总RNA提取 将上述置于-70 ℃冰箱保存的唇腺组织放入含有1.5 mL RNAiso Reagent的离心管中，进行匀浆至浆液呈透明状，室温下静置5 min；取上清液，加入等体积异丙醇，再次离心后取沉淀物经清洗溶解后保存于-70 ℃冰箱备检。

1.2.3 引物设计 根据Genebank中TLR4、CD14基因序列（ACCESSION NM 003266）、（ACCESSIONNM 000591），采用引物设计软件primer premier 5设计引物：TLR4引物：上游：5-AAA GCC CTG CTG GAT GGT AAA T-3（2724-2745），下游：5-TTG AAA TGC CCA CCT GGA AGA C-3（3027-3006），擴增产物长度304 bp；CD14引物：上游：5-CGT GGG CGA CAG GGC GTT CTT-3（812-832），下游：5-TCC CGT CCA GTG TCA GGT TAT CCA-3（1139-1316），扩增产物长度528 bp；β-actin：作为阳性对照，上游：5-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3（1380-1399），下游：5-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3（1664-1645），扩增产物长度285 bp。

1.2.4 TLR4、CD14mRNA检测 按RT-PCR产品试剂盒说明书检测。

1.2.5 TLR4、CD14 蛋白检测 采用Envision （Enhanced labeled polym ersystem）法检测，具体按试剂盒说明书检测。

1.3 统计学处理 使用SPSS 12.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组唇腺组织中TLR4、CD14 mRNA的表达

2.1.1 TLR4、CD14 mRNA RT-PCR产物电泳结果比较 TLR4、CD14 mRNA RT-PCR结果，见图1和2。

2.1.2. TLR4、CD14 mRNA半定量结果 干燥综合征组TLR4 mRNA和CD14 mRNA的表达均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 两组唇腺组织中TLR4和CD14蛋白的表达

2.2.1 表达结果 干燥综合征组高表达TLR4和CD14，对照组未出现TLR4、CD14表达，见表2和图3～6。

2.2.2 TLR4和CD14蛋白表达与病理分级的关系 根据文献[5-6]的分类法，将唇腺组织中的淋巴细胞浸润程度分为0～4级，检测不同分级标本中TLR4、CD14的综合阳性率，结果显示，前三级中分级越高，TLR4、CD14阳性率也越高，其阳性率分别为：0～1级TLR4、CD14的阳性率为62.5%，2级阳性率为70.0%，3级76.0%，4级的唇腺组织破坏严重，TLR4、CD14表达率明显下降为58.3%，不同病理间TLR4、CD14阳性率比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.2.3 TLR4、CD14在唇腺组织中的表达 对照组20例唇腺标本中未见TLR4、CD14表达，研究组的唇腺导管上皮细胞中有64.4%表达TLR4、CD14，在唇腺组织的淋巴细胞灶中TLR4、CD14的表达为67.8%，差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

干燥综合征（SS）是一种以外分泌腺组织中出现大量淋巴细胞浸润为特征的自身免疫性疾病，最常见的症状是口眼干燥，其临床表现多种多样，是一种系统性疾病，人体的任何系统和器官均可受累，其中肾脏受累导致肾小管病多见，恶性淋巴细胞增殖是其另一特点[5]。SS的病理特点是在外分泌腺的柱状上皮中出现大量浸润的淋巴细胞、浆细胞和单核细胞，形成滤泡样结构，临床上称之为淋巴细胞灶，随着病情的进一步发展，外分泌腺出现腺管狭窄、萎缩、扩张以及纤维化。

SS的病因及發病机制有多种学说，其中细菌感染与SS发病的关系研究较少，在临床工作中笔者观察到，细菌感染常常导致SS患者病情加重或者出现症状，SS患者最常见的感染莫过于口腔内革兰阴性菌。革兰阴性菌进入人体可以释放LPS，LPS可以通过TLR4-CD14信号传导系统启动免疫反应。

TLR4属于Toll样受体，是参与固有免疫的一类蛋白质分子，也是连接获得性免疫和固有免疫的桥梁[6]。当人体的物理屏障如皮肤、黏膜，被微生物突破后， TLR可以识别它们并激活人体免疫应答反应。CD14，即LPS受体，是一种存在于单核细胞、巨噬细胞表面的白细胞分化抗原，其生物活性是识别、结合LPS，介导LPS性细胞反应。

文献[7-9]研究显示，33%～100%唇腺上皮细胞表达HLA-DR抗原，具有抗原提呈功能，可导致免疫反应发生；文献[10-11]检测到SS患者唇腺上皮细胞高表达TLR2、TLR3、TLR4及髓样分化因子MyD88，提示TLR参与了SS的发病过程。文献[12-13]体外培养SS唇腺上皮细胞，结果显示TLR1、TLR2、TLR3和TLR4分子的表达明显高于对照组。文献[14-18]研究推断在SS发病中唇腺上皮细胞并不是“无辜旁观受害者”，而是SS发病的主动参与者。

本研究对SS患者的唇腺组织采用RT-PCR法和免疫组化法检测其TLR4、CD14 mRNA和蛋白的表达，结果显示，SS患者高表达TLR4、CD14 mRNA；TLR4和CD14蛋白检测也显示SS组明显增高，而对照组唇腺组织中未见TLR4和CD14表达，提示TLR4和CD14参与了SS外分泌腺体炎症，淋巴细胞的浸润与TLR4和CD14有密切关系；本研究还发现TLR4和CD14的表达均位于浸润的淋巴细胞和唇腺导管上皮细胞，表达呈胞浆型，在SS唇腺腺泡细胞上均未发现TLR4和CD14的表达，这一结果表明导管上皮细胞参与了SS的发病过程，腺泡细胞是免疫炎症的受害者，本研究结果与文献[19-20]的研究结果一致。进一步分析还可以看到，随着淋巴细胞浸润程度的提高TLR4和CD14的表达阳性率也明显增高，而当唇腺组织出现明显纤维化时，TLR4和CD14的表达出现下降，这一结果也进一步证明，TLR4、CD14与腺体中淋巴细胞的大量浸润密切相关。本研究结果提示，TLR4、CD14在干燥综合征患者唇腺导管上皮细胞高表达，细菌感染可能通过LPS-TLR4-CD14信号传导通路参与干燥综合征的发病过程，这一研究结果将为临床预防和治疗SS提供新思路。

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（收稿日期：2016-10-12） （本文編辑：程旭然）