构建组织工程血管的支架材料和种子细胞研究进展

潘兴纳，蒲磊，李亚雄，侯宗柳，蒋立虹

(1.昆明医科大学附属延安医院心脏大血管外科，云南 昆明 650051；2.昆明医科大学附属延安医院科研部，云南 昆明 650051；3.云南省第一人民医院，云南 昆明 650032)

构建组织工程血管的支架材料和种子细胞研究进展

潘兴纳1，蒲磊1，李亚雄1，侯宗柳2，蒋立虹3

(1.昆明医科大学附属延安医院心脏大血管外科，云南 昆明 650051；2.昆明医科大学附属延安医院科研部，云南 昆明 650051；3.云南省第一人民医院，云南 昆明 650032)

国内外学者已对用于构建组织工程血管的支架材料和种子细胞进行了较多的研究，以期研制出能代替自体血管用于临床的血管移植物，它应具备良好的生物相容性、适应性重塑和生长的潜能。虽然组织工程研究已开展30多年并取得一定成果，但是仍有许多问题亟待解决。如何研制出理想的支架材料和选择合适的种子细胞有待进一步研究。综述近年用于构建组织工程血管的支架材料和种子细胞的研究进展。

组织工程；血管；支架；种子细胞；间充质干细胞

动脉粥样硬化严重影响人类健康和生活质量，居全球死亡原因的首位。目前，该病的治疗包括：球囊血管成形、支架植入、血管旁路移植和药物治疗。先天性心脏病严重影响患者的健康，药物治疗仅能缓解部分临床症状，部分复杂先天性心脏病的治疗尤为棘手。随着基础研究和外科治疗技术的快速发展，戊二醛固定的异种血管和应用高分子聚合物(涤纶、聚四氟乙烯乙烯)人工构建的心外管道用于重建血液循环已成为复杂先天性心脏病的有效治疗方法，如：改良Fonton术、Rastelli术，然而，血管直径不匹配、内膜增生、血栓形成、钙盐沉积、顺应性差、缺乏生长和重塑潜能等多种因素限制他们的临床应用[1-3]，且多需要再次手术干预[4]。自体动脉或静脉是小直径血管移植的“金标准”，然而，30%～40%的患者因外伤史、手术史、血管病变等导致自体血管不能满足旁路移植手术需求[5-6]。理想血管移植物的缺乏严重影响了患者的治疗，加重家庭和社会负担，寻求和制备理想的血管替代物(尤其是小直径血管替代物)已经成为临床研究的热点。

组织工程血管(tissue engineering blood vessel，TEBV)是指运用工程学和生命科学的原理、方法和技术，模拟目标血管的结构和功能来开发具备一定生物活性的组织替换物以重建、维持、提高受累血管的生理功能[5，7]。应用组织工程理念构建的大直径血管作为心外管道应用于复杂先心病患者获得理想的效果，移植物呈现出适应性重塑和生长的潜能[8-9]，而组织工程小直径血管研究尚未取得较大突破，本文就用于构建组织工程血管的支架材料和种子细胞的研究进展进行综述。

1 支架材料

支架材料为种子细胞的生长和血管新生提供必要支撑，是细胞粘着、生长和新陈代谢的平台，是制备组织工程血管的先决条件。理想的组织工程血管支架应具备以下特点：(1)良好的生物组织相容性；(2)适宜的三维立体结构、长度、容积；(3)可控的生物降解性和降解率，降解产物对机体无毒副作用、不引起强烈的免疫排斥反应和炎症反应；(4)良好的多孔结构，易于种子细胞种植、迁移，细胞彼此之间相互接触，易于生物信号分子的传递；(5)具备一定的生物表面活性，能促进种子细胞黏附，并为种子细胞增殖、分化、分泌细胞因子和合成细胞外基质提供良好的生物微环境；(6)一定的可塑性和良好的生物机械力学强度，不抑制生物信息的传递；(7)方便消毒、保存、运输；(8)支架在重塑过程中具备一定的耐久性[10-11]。在过去近30年的时间里，组织工程血管支架材料由简单的不可降解聚合物材料发展到高分子可降解材料、生物材料和杂交复合材料，其设计和加工的方式已发展到具有巨大潜力的快速成型技术、静电纺丝技术和3D打印技术等，取得了令人瞩目的成绩。现阶段，按其来源和性能，主要将组织工程血管支架分为不可降解材料、可降解高分子合成材料、可降解天然生物材料、复合材料四大类[12-13]。

1.1 不可降解血管支架材料 人工支架材料(如涤纶、聚四氟乙烯等)已被用于构建组织工程血管。目前，涤纶管道主要用于主动脉，理论上认为，涤纶移植物卷曲长轴能增加灵活性、弹性和扭结阻力，然而这些属性因移植后组织再生而丧失[14]。聚四氟乙烯是一类具多孔结构的不可降解性聚合物，应用于中、大直径血管取得相对较好的中远期结果，然而，它的血液相容性和细胞相容性欠佳，易于血栓形成和内膜增生，在小直径血管(＜6 mm)中应用受到明显限制。有学者试图用肝素、水蛭素、一氧化氮、葡糖氨基聚糖类、磷酰胆碱、白蛋白、聚合物等改良支架结合原位内皮形成理念来克服血栓形成；同时有学者通过支架表面种植血管内皮细胞和间充质干细胞以形成抗血栓的内膜表面，虽然取得一定成效，但均未取得十分理想的效果[2，15]。更何况，临床上需求较多的是小直径血管移植物，因其血流速度和血压随血管直径减小呈进行性下降，血流易于停滞，对血管移植物的要求更高。涤纶和聚四氟乙烯构建直径小于6 mm的小血管均未获得满意的效果[16]，目前，这类支架材料已逐渐被淘汰。

1.2 可降解高分子合成支架材料 基于可降解的聚合物支架材料体外种植细胞一直是组织工程血管研究的重点，随着支架材料的降解，种植的细胞合成并分泌细胞外基质以重塑形成新的血管。目前，国内外研究较多的可降解聚合物有聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)以及两者的混合物聚乳酸羟基乙酸(PLGA)、聚已酸内酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)、聚左旋乳酸(PLLA)、聚羟基丁酯(P4HB)、聚羟基辛酯(PHO)、聚氨酯(PU)等。这些材料可标准化生产，通过水解作用降解，易于塑形为目标结构，具有可控的机械性能和降解率，已成为组织工程领域研究的热门材料。但这些高分子合成材料仍各有弊端，如PGA材料在医用材料方面有着一定用途，但是在体内降解过快，降解产物很容易引起炎症反应；PLA在体内降解产物是乳酸，虽然无毒害作用，但它的细胞亲和力较差；PHB具有良好的可控制降解性能，且降解产物对机体无毒害作用，但它的细胞相容性欠佳[17]。这些聚合物材料缺乏种子细胞增殖、粘附和调节体内重塑相关的生物信息，缺乏生物相容性[18]等不利因素使其应用于血管支架受到了限制。近年将多个聚合物混合共聚构建支架，若把不同高分子聚合物按一定的比例进行共聚，可让相应聚合物的优势最大化，可显著改善其物理及生物学性能。Andukuri等[19]应用静电纺丝技术构建聚乙酸内酯支架，支架装载两亲水脂分子，显著增加了内皮细胞粘附，减少血小板聚结，但其降低平滑肌细胞的增殖。Naito等[20]联合聚乙醇酸/聚乙醇酸/聚乳酸等三种聚合物构建支架材料，种植骨髓来源的单核细胞获得组织工程血管，建立C57BL/6 mice下腔静脉间位植入模型，随着移植物的降解，细胞逐渐合成胶原、弹性蛋白、糖氨聚糖类等细胞外基质，移植物通畅。Williamson等[21]联合静电纺丝技术，将多孔的聚氨酯织于聚已酸内酯构建支架，种植脐静脉内皮细胞，结果显示该支架能显著增强内皮细胞粘附、分泌相应细胞因子和传递细胞因子。随着纳米科技、静电纺丝技术[22-23]和3D打印技术[24]的发展，为组织工程血管支架材料研究提供了一个崭新的平台，也解决了现存的一些问题。联合先进高科技技术构建的组织工程血管支架材料能为种子细胞增殖、粘附和分泌细胞外基质提供微环境，能够可控地使干细胞表达自身的生物学功能和分化。联合纳米材料可在组织工程血管支架内膜面固化一些具有抗血栓形成功能的分子，形成非细胞性的纳米抗血栓表层，这些分子实现抗凝目的的同时明显提高内皮表面形成[25-26]。随着材料科学和高科技技术的快速发展，可降解高分子材料被众多学者寄予厚望，但其真正成为组织工程血管理想的支架材料还需进一步研发。

1.3 生物支架材料 常用的可降解生物支架包括脱细胞血管基质、纤维蛋白凝胶、胶原、透明质酸等。他们能为细胞粘附及生长提供生物信号，特别是脱细胞的细胞外基质作为支架，其充分利用细胞外基质独有的三维立体结构和生物活性，通过体外细胞种植，内膜面形成内皮细胞层可有效预防血栓的形成。生物支架材料的优点：(1)良好的细胞相容性；(2)组织相容性好，免疫原性低，很少引起机体的免疫排斥反应；(3)具有生物降解性，其降解产物无毒副作用；(4)理想的生物机械力学性能，能满足机体血流动力学要求；(5)来源广泛，可作为“off-the-shelf”支架；(6)柔韧性良好，易于手术操作[27-28]。脱细胞的血管基质是最常用的天然生物材料，它具有天然的血管的细胞外基质结构。Schaner等[29]应用十二烷基硫酸钠(SDS)对人大隐静脉进行脱细胞，内皮细胞完全去除，静脉壁间细胞清除率达94%，胶原、弹性蛋白和基底膜结构保留完整，生物机械力学性能良好。随后该团队用相同的方法对犬颈外静脉进行脱细胞，随后将同种脱细胞的移植物间位植入颈动脉，术后两周移植物未见扩张、狭窄及吻合口并发症。Gui等[30]联合表面活性剂CHAPS、EDTA和SDS对脐动脉脱细胞，亦获得有应用潜能的小直径血管支架。此外，亦有学者应用相近的方法对牛颈静脉[31-32]、马颈动脉[33]、猪颈动脉[34]、犬颈动脉[35]进行脱细胞处理，对脱细胞支架进行初步评估，体外实验及短期体内实验结果理想，但其应用前景尚缺乏中长期的大动物实验数据支持，有待进一步研究。联合聚合物支架的降解特性、种子细胞能合成细胞外基质的生物学特点，应用生物反应器动态培养，随着支架降解和细胞合成细胞外基质，随后对其进行脱细胞处理，通过该理念可获得同种血管支架材料[36]，该理念值得进一步深入研究。

纤维蛋白是细胞外基质中重要的结构蛋白和功能蛋白，具有弹性、自我组装、长期稳定性和生物学活性，这类天然的生物高分子具有较好的生物相容性，参与组织损伤修复后血管生成，具有可控的生物降解性[37]，其可以作为细胞和生长因子传递的良好平台，纤维蛋白有希望模拟活体微环境支持细胞粘附、分化、增殖，能促进细胞存活和细胞外基质成分合成。黄程程等[38]用人脐静脉内皮细胞种植在纤维蛋白凝胶上，观察其形成血管样管腔结构，结果显示当细胞密度为1.5×104个/孔，纤维蛋白原的浓度为0.5 mg/mL，凝血酶的浓度为0.1 mg/mL，血清的浓度为10%时，内皮细胞在纤维蛋白凝胶上面生长良好，得到比较规则理想完整的血管样管腔结构。纤维蛋白可联合各种生长因子和其他成分，体外塑性获得支架，可作为理想支架材料的添加剂[39]。

胶原蛋白和弹性蛋白是血管细胞外基质的主要成分，能提供适宜的机械应力和张力，具有低抗原性和生物降解性。通过调控冷冻温度、冰结晶形成、溶液酸碱度和胶原的浓度可获得多孔的胶原蛋白支架[37]，然而，胶原纤维和胶原凝胶临床应用的主要缺陷在于其过于僵硬且血小板易于粘附于其表面而形成血栓[17]。透明质酸是具有良好弹性的聚糖成分，具有低免疫原性和低血栓形成特性，能促进细胞粘附，其可能的分子机制在于透明质酸中包含促细胞粘附的分子亦适用于其他支架材料构建支架的佐剂。

1.4 复合支架材料 复合支架集各组分的优点于一体，能获得生物材料细胞亲和力强和包含细胞因子的优势，兼备聚合物材料可控的降解率、塑形、机械性能和结构等优点，具有支架涂层抗血栓、促进细胞粘附和再植等特性。这样获得的复合材料，继承了多种材料的优点，发挥各自优势，相辅相成，它具有天然血管的特质，更好地满足组织工程血管的要求，是组织工程血管支架材料研究的重要方向。有学者通过静电纺丝技术制备“胶原-壳聚糖-聚左旋乳酸聚己内酯”支架，得到纤维平均直径为224 nm、血管支架长度为0.9 cm的多层复合血管组织工程支架，其具有良好的力学性能和生物相容性，适用于组织工程血管移植[40]。莫秀梅等[41]将乳酸己内酯共聚物纺丝液和胶原蛋白纺丝液进行单喷头静电纺丝，或分别进行双喷头静电纺丝，成功发明了具有良好力学性能和生物相容性的血管支架，其特殊的双层结构能够仿生天然血管结构。复合材料制备的小口径管状支架，既能克服天然生物高分子材料力学性能的不足，又能避免合成材料在生物相容性和安全性的缺陷，成为制备小口径血管组织工程支架的必然趋势。尽管这类支架采用了各种手段避免血栓、炎症等不良反应，其生物相容性仍旧无法与天然材料相比。因此，在天然材料与合成材料之间找到一个最佳比例，使复合材料的力学性能和血管相容性等达到一个平衡，将会显著提高支架在小口径血管组织再生中的应用。同时制备多层血管，进行功能化修饰，模拟天然细胞外基质的结构和功能，将成为用于心血管组织修复及组织工程小口径血管研究的新方向。

2 种子细胞的选择

种子细胞在血管支架上体外种植，模拟构建天然血管结构，血管移植后以便其能行使正常的血管功能，形成抗血栓表面。多种细胞已运用于组织工程血管的研究，但何种细胞是组织工程血管最佳的种子细胞尚无定论，所以获得理想的种子细胞有待进一步研究，而作为种子细胞应具备以下的特点：(1)体外增殖能力强，短期内能达到预想的细胞数目；(2)形成完整的细胞表面，具备抗血栓性能；(3)易于获取，实用性强；(4)有一定的合成、分泌功能；(5)低免疫原性或无免疫原性，临床运用安全可靠；(6)移植后体内存活时间长。目前研究较多的有以下几种：

2.1 成熟体细胞 自体血管来源的内皮细胞和成纤维细胞[42]早年即被用于构建组织工程血管。血管内膜完整的血管内皮细胞表面是血液与血小板粘附基质的障碍，同时内皮细胞合成多个抗凝血分子、调节血小板粘附和激活、调节纤维蛋白溶解，此特有的抗血栓性能曾经被认为是最理想的组织工程细胞，然而其多取自大隐静脉且体外增殖能力有限，来源于成人血管的内皮细胞在体外很快进入增殖期，研究显示随培养周期的延长，细胞及其基质形成呈现增加的趋势，但传代4～6代后其增殖活性逐渐下降，随着时间延长就会出现细胞“去分化”和“老化”等问题，逐渐丧失特有功能[43]。成纤维细胞作为结缔组织最主要的细胞成分，在分泌细胞外基质成分、构建细胞外基质和创伤修复过程中发挥重要的作用，且具有较强的分裂增殖能力，适应性强，用其来模拟血管中膜的平滑肌细胞及充当细胞外基质成分。获取自体血管会增加患者额外创伤，牺牲供体血管完整性，实验研究具可行性，但这种方案的临床运用有一定的局限性，因此寻找一种创伤小的种子细胞获取方法非常必要。

2.2 干细胞 干细胞因其来源广泛、易于获得、体外增殖能力强、具有多向分化潜能和旁分泌功能等优势受到众多研究者的青睐。干细胞来源大致可分为三类：成体干细胞、胎儿附属物来源的干细胞、诱导多潜能干细胞。骨髓来源的间充质干细胞与血细胞和血小板具备一定的相容性，其表现出类似血管内皮细胞的抗血栓性能和良好的血液相容性[2]，且具备多向分化的潜能，其旁分泌功能有易于循环血液中的干细胞、前体细胞参与组织工程血管在体内的重塑。胚胎干细胞的应用受到伦理学的限制且具恶性分化潜能，诱导多潜能干细胞虽能克服伦理学限制和跨越免疫排斥，但其体外诱导分化率低，恶性分化的风险使临床运用受到一定限制。胎儿附属物来源的间充质干细胞(脐带、羊膜、羊水)与骨髓间充质干细胞具有相似的细胞生物学性能和表面标记[44-46]，有研究显示随年龄增长，骨髓间充质干细胞增殖、分化能力下降[43]，且胎儿附属物来源间充质干细胞的增殖、分化能力优于成人骨髓间充质干细胞，脐带作为分娩后的丢弃物，来源广泛、易于获取，无疑可成为组织工程血管理想的种子细胞。通过基因修饰将0ct3/4、Sox2、Klf4、和c-myc等外源基因转入体细胞，可获得诱导多潜能干细胞，它的分化潜能接近胚胎干细胞，可跨越伦理限制和异体免疫排斥，Hibino等[47]将诱导多潜能干细胞种植于聚合物共聚支架构建小直径血管，间位植入免疫缺陷小鼠的下腔静脉，10周后对移植物进行评估，结果显示移植物通畅，未见血栓、钙化、动脉瘤形成和移植物破裂。理论上能成为组织工程血管适宜的种子细胞，但是，诱导多潜能干细胞有恶性分化潜能，外源基因的安全性有待研究。

3 小 结

组织工程血管研发至今，虽已取得令人瞩目的成绩，仍存在很多问题亟待解决，还未达到满足临床需求的效果。限制组织工程血管研究的关键因素仍是支架材料和种子细胞的选择，随着各方面研究的进一步深入，相信组织工程血管将让患者从中获益，解决实质性的临床问题。

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Research progress of scaffold materials and seed cells in construction of tissue engineered blood vessel.

PAN Xing-na1,PU Lei1,LI Ya-xiong1,HOU Zong-liu2,JIANG Li-hong3.1.Department of Cardiovascular Surgery,Yanan Hospital Affiliated to Kunming Medical University,Kunming 650051,Yunnan,CHINA;2.Department of Scientific Research, Yanan Hospital Affiliated to Kunming Medical University,Kunming 650051,Yunnan,CHINA;3.The First People's Hospital of Yunnan Province,Kunming 650032,Yunnan,CHINA

In order to develop vascular grafts which can substitute for autologous blood vessels and be used for clinical practice,scholars at home and abroad have conducted much research on the scaffold materials and seed cells in construction of tissue engineered blood vessel.These vascular grafts should have good biocompatibility,adaptive remodeling and growth potential.Tissue engineering research has been carried out for more than 30 years and some achievements have been made,but there are still many problems to be solved.How to develop the ideal scaffold material and select the appropriate seed cells still remain to be further studied.In this review,we summarize the recent research progress on scaffold materials and seed cells in construction of tissue engineered blood vessel.

Tissue engineering;Blood vessels;Scaffolds;Seed cells;Mesenchymal stem cells

R541.4

A

1003—6350（2017）03—0446—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.03.034

2016-05-29)

云南省科技厅-昆明医科大学联合专项(编号：2013FB187、2013FB189)；云南省卫生科技计划项目(编号：2014NS208，2014NS209)

蒋立虹。E-mail：jianglihong_yayy@163.com