猪链球菌的分离鉴定及药敏试验

宋子杰 孙鑫鹏 王 妍 韩先杰 （青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛 266109）

猪链球菌的分离鉴定及药敏试验

宋子杰 孙鑫鹏 王 妍 韩先杰*（青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛 266109）

为了确定某猪场仔猪死亡的主要病原菌，分析该病原菌的耐药性，本试验对病死猪进行剖检，并从肺脏、脾脏中分离到一株细菌，随后进行分离菌形态观察、生化试验、细菌16S rRNA基因测序与药敏试验。结果表明该株分离菌为革兰氏阳性链状球菌，生化试验结果与链球菌的生化试验结果大致相符；细菌的16S rRNA基因序列经Blast同源性比较，与猪链球菌(GenBank CP007497.1)同源性为99%；药敏试验结果表明该株分离菌对氟喹诺酮类、β-内酰胺类多种药物敏感。细菌分离鉴定和药敏试验的结果为猪场发生该病时药物治疗提供参考依据。

猪链球菌 分离鉴定 药敏试验

猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起不同临诊类型的传染病的总称，临床上引起猪链球菌病的主要是猪链球菌[1-3]。2016年8月，青岛某猪场65日龄左右的仔猪突然发生死亡。经调查后发现，病猪生前的精神状态、食欲无明显异常。现场对部分病死猪进行尸体剖检，病死猪的解剖病变大致相同，主要表现为心包积液、混有黄色胶冻样渗出物；肺部肿胀、淤血；肝脏肿胀、淤血；脾脏明显肿大、淤血，颜色呈蓝紫色。发病已持续

20d左右，造成5头仔猪死亡，给养殖场造成较大的经济损失。为探明病因，进一步做好该病的防治工作，本文对病死仔猪进行了病原菌分离鉴定与药敏试验，以期为猪场用药治疗该病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源 青岛市某猪场送检的病死仔猪，无菌采集病变明显的肺脏、肝脏。

1.1.2 主要试剂 PCR试剂(10×PCR Buffer、dNTPs、Ex Taq酶)、DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；脑心浸液培养基购自青岛海博生物技术有限公司；通用型柱式基因组提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；药敏纸片、细菌微量发酵管购自杭州滨和微生物试剂有限公司；绵羊鲜血琼脂平板(80ml/L)为青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室自制。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离 无菌取病死猪的肺、脾组织，划线接种于绵羊鲜血琼脂平板上，37℃培养24h，观察细菌生长特性。挑取单个菌落进行革兰氏染色、镜检，观察细菌的形态。

1.2.2 生化试验 挑取单个分离菌接种于细菌微量发酵管中，37℃培养18～24h，观察、记录生化反应结果。

1.2.3 16S rRNA基因的PCR扩增 按照通用型柱式基因组提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA。参照文献报道的方法合成一对用于扩增细菌16S rRNA基因序列的通用引物[4]，上游引物：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；下游引物：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT -3′，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。以基因组DNA为模板进行PCR反应，PCR反应体系(50μl)包括：DNA模板2.0 μl，上、下游引物各2.0μl，Ex Taq酶1.0μl，dNTP 4.0μl，10×PCR Buffer5.0μl，去离子水34.0μl。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1.5min，扩增32个循环；72℃延伸7min，4℃终止反应。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 PCR产物测序 将纯化的PCR扩增产物送交宝生物工程(大连)有限公司测序，利用NCBI的BLAST工具将分离菌的16S rRNA的基因序列进行同源性比对。

1.2.5 动物试验 将分离菌的纯培养物接种于已灭菌的脑心浸液培养基中，于37℃培养18～24h，并计算活菌数。选取3只健康ICR小白鼠，每只腹腔注射菌液0.2ml (1.8×108CFU/ml)；另取3只体重相近的健康ICR小白鼠，每只腹腔注射等量灭菌脑心浸液。小鼠攻毒后连续观察7d，记录其临床症状及死亡情况。

1.2.6 药敏试验 参照Kirby-Bauer琼脂扩散法进行分离菌的药敏试验[5]，按照文献报道的方法进行药物敏感性的判定[5, 6]。

2 结果

2.1 细菌分离与形态观察

37℃培养24h后，绵羊鲜血琼脂平板上长出针尖大小、灰白色、半透明、边缘整齐的小菌落，呈β型溶血。经革兰氏染色、镜检，结果为革兰氏阳性球菌，多呈单个双球型或短链状排列。

2.2 生化试验结果

该株分离菌能够发酵乳糖、甘露醇、蔗糖等，不产硫化氢，MR试验为阳性，VP试验为阴性(见表1)。该分离菌的生化反应结果与链球菌的生化反应结果大致相符[6,7]。

表1 细菌的生化试验结果

2.3 16S rRNA基因的PCR扩增

分离菌16S rRNA基因序列的PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳结果显示，出现与预期大小相符、大小约1500bp的目的条带(附图)。

附图 PCR 扩增分离菌16S rRNA 基因结果M. DNA标准DL2000； 1. 分离菌；2，阴性对照M. DNA Marker DL2000; 1. isolated bacterial strain; 2. negative control

2.4 基因测序分析

利用NCBI的BLAST工具将分离菌16S rRNA基因序列与数据库中的序列进行了同源性比对分析，结果显示该菌与猪链球菌序列(GenBank序列号CP007497.1)同源性为99%，因此可确定分离菌株为猪链球菌。

2.5 动物试验

攻毒的小鼠出现精神沉郁、不愿活动、呼吸困难，于24h内全部死亡。剖检死亡的小鼠可发现心包和腹腔积液，肝脏、脾脏、肾脏肿大。取病变组织涂片、革兰氏染色镜检，可发现大量革兰氏阳性短链状球菌，而腹腔注射脑心浸液肉汤的小鼠在观察期内一直健康存活。

2.6 药敏试验

分离菌各种药敏纸片的抑菌直径测量结果见表2。结果表明该株分离菌对氟喹诺酮类、β-内酰胺类等多种药物高度敏感，对多粘菌素B、林可霉素耐药。

表2 分离菌的药敏试验 (μg、mm)

3 讨论

（1）链球菌广泛分布于自然界，可以引起多种化脓创和败血症，也可表现为各种局限性感染[8]。仔猪感染链球菌，多是由母猪作为传染源引起的，主要经呼吸道和受损的皮肤及黏膜感染[9]。本研究的病料来自2016年8月青岛某养猪场的病死仔猪，根据解剖病变结果，进一步结合细菌分离、生化试验和分子生物学技术鉴定，最终确诊为链球菌感染，分离菌对小鼠有一定的致病力。（2）链球菌一般要在一系列的诱因作用下才能发病，因此，建议养殖场定期打扫卫生、及时消毒，减少链球菌发病的诱因[10-12]。对发病猪用含增效剂的阿莫西林按100mg/L饮水给药，用百毒杀对猪舍进行消毒，及时清理猪舍内的粪尿。采用上述方法1周内无仔猪发病，随访4周，无新病例出现，说明该猪场中猪链球病得到控制。由于猪链球病的传染性比较强，容易由散发变为集体大规模发病，所以这次病理诊断及治疗也为后续的猪群饲养中该病的防控提供参考，防止该场猪链球菌病的大规模发生。另外，当猪场发生细菌性疾病时，应当结合药敏试验，选择敏感药物进行治疗，注意交替用药，避免产生耐药性。

[1] 陶明华, 肖焕星, 欧伟业. 一例败血性猪链球菌病的诊治体会[J].猪业科学, 2016, 33: (4): 77.

[2] 王庚, 方奎, 陈基萍. 一起猪急性败血型链球菌病的诊治[J]. 猪业科学, 2016, 33(3): 73-74

[3] 蒋新华, 邓舜洲, 张文波等 猪链球菌病病原的分离鉴定及药敏试验[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(12): 170-172.

[4] 陈香碧, 苏以荣, 何寻阳等. 喀斯特原生土壤与退化生态系统土壤细菌群落结构[J]. 应用生态学报, 2009, 20(4): 863-871.

[5] CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing(Twenty-Third Informational Supplement) , 2013.

[6] 郝春燕, 王利勤, 王晶钰. 猪链球菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 动物医学进展, 2010, 31(5): 124-128.

[7] 王华, 赵云玲, 王君玮等. 猪链球菌病流行病学及其疫苗研究现状[J]. 动物医学展, 2006, 27(9): 27-31.

[8] 拜廷阳, 闫若潜, 吴志明等. 猪链球菌病研究进展[J]. 动物医学进展, 2007, 28(9): 83-87.

[9] 罗满林. 动物传染病学[M]. 北京: 中国林业出版社, 2013: 123.

[10] 李晨, 豆丽新. 猪、牛链球菌病的诊断及防制[J]. 养殖技术顾问, 2010, 08(6): 114-115.

[11] 王刚, 孙磊, 李祥林等. 猪链球菌的分离鉴定和药敏试验[J]. 甘肃畜牧兽医, 2016, 46(11): 71-72.

[12] 许信刚, 魏拣选, 张琪等. 猪链球菌2型的分离鉴定及免疫预防[J]. 动物科学与动物医学, 2003, 20(3): 21-22.

S855.1+1

A

1007-1733(2017)02-0001-02

2016–10–21）

*通讯作者