茶树II型核糖体失活蛋白基因CsRIPI和CsRIP2的克隆与表达

孙楠+付云磊+李　伟

（1.黄淮学院，河南驻马店 463000；2.天方药业，河南驻马店 463000）

摘 要 克隆茶树II型核糖体失活蛋白基因CsRIPI和CsRIP2，能够参与茶树的防卫反应，加深对CsRIPs基因转录调控以及RIPs的生物学功能理解。以凫早2号的幼苗为实验材料，对茶树II型核糖体失活蛋白基因CsRIPI和CsRIP2进行了研究，其在营养钵生长了2 a，分析了CsRIP基因克隆与序列、CsRIP因编码产物的系统进化树、CsRIP基因在不同组织中的表达等，并对CsRIP基因编码产物的结构域分析和同源性进行了比较。

关键词 茶树；II型核糖体；失活蛋白基因；CsRIPI；CsRIP2

中图分类号：Q943.2 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.24.087

1 材料与方法

1.1 实验材料

选择茶树品种“凫早2号”的幼苗进行假眼小绿叶蝉和机械伤害处理，其在营养钵中生长了2 a。在处理材料之前，笔者在光照时间12h/b，强度160μmol/（m2·s1），温度25～28 ℃的条件下，让茶树幼苗生长了7 d。假眼小绿叶蝉处理：用通风良好的塑料网，将茶树幼苗罩上，将50个左右的假眼小绿叶蝉成虫，接种到每一株茶树上，3、6、12、24、48h后，将充分伸展的茶树叶片剪取。机械伤害：将茶树叶片的边缘用剪刀剪去，分别在处理3、6、12、24、48h后剪取叶片。为了培养在相同条件下没有进行处理的茶树幼苗作为对照，每次取6株。每种处理3次重复。对照和各种处理的叶片采集后，置于-80℃冰箱中保存，迅速用液氮处理[1]。

1.2 CsRIP2基因cDNA的克隆

從茶树叶子中，利用RNeasy plantmini kit提取总RNA，而总RNA则用DNaseI去除其中残余的DNA。合成第1链cDNA采用了First Strand c DNA Synthesis 试剂盒，利用特异引物CsRIP-F2和CsRIP-R2扩增Csrip2基因的cDNA序列。凝胶电泳PCR产物后，将目的片段与pMD19-T载体连接并转化DH5α，对质粒进行重组后测序。

1.3 CsRIP1 基因全长cDNA的克隆

设计1对特异性引物CsRIP-F1和CsRIP-R1时，根据Cs-Ev2cDNA片断的核苷酸序列，并用于5，RACE和3，RACE。利用5，通用引物和CsRIP-R1扩增该基因cDNA的5，末端，以 5-ready RACE cDNA文库为模板；利用3，通用引物和CsRIP-F1扩增该金银的3，末端，以3-ready RACE cDNA文库为模板；拼接这两个产物，根据5和 3非编码区序列设计引物得到CsRIP-F2、CsRIP-R2，得到CsRIP1的全长cDNA，扩增该基因完整的ORF，反映程序都为：96℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环。

1.4 CsRIP基因组DNA的克隆

以茶树叶片为材料，按照Plant DNAIsolation Reagent试剂盒说明书，提取茶树的基因组DNA。利用特异引物，以基因组为模板，扩增CsRIP基因的gDNA序列。

1.5 Real-time qRT-PCR 分析 CsRIP 基因的表达

分别选取茶树的幼根、茎、叶片和子叶，采用Real-time qRT-PCR分析CsRIP的基因表达，用Trizol Reagent提取总RNA，检测其完整性和浓度，采用了琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计。合成第1链cDNA采用了First Strand c DNA Synthesis试剂盒，用于检测不同组织中CsRIP1和CsRIP2的表达水平。为了检测CsRIP基因的表达水平，选取完全伸展，经过不同处理的茶树幼苗叶片，分别提出总RNA。

设计CsRIP1基因特异性的实时荧光定量RT-PCR，根据2个CsRIP基因3 UTR的差异性区域，分析引物CsRIPI-R、CsRIP1-R。采用茶树的α-tubulin基因作为内参对不同样品cDNA模板量进行校准。进行实时荧光定量PCR反应按照TaKaRa公司的试剂盒说明书，且每个样品设3次重复，是定程序使扩增结束后PCR仪自动运行绘制溶解曲线。在组织表达分析中，用表达量最低的组织作为对照，以未处理的材料作为对照。

2 结果与分析

2.1 CsRIP基因克隆与序列分析

扩增后，分别得到1条特异条带，发现5，RACE产物长1330bp，3，端RACE产物长936bp。前者3，端序列与

Cs-Ev2的5，端序列完全重叠，后者5，端序列与Cs-Ev23，端序列完全重叠。拼接后得到2032bp的全场cDNA，该序列包含5，非翻译区73bp、3，非翻译区224bp、阅读框1713bp等，其等电点位4.75，预测分子质量为63.55kDa。植物的II型RIPs常常在植物的种子中积累，本文通过上述实验方法，发现了2个新的茶树II性核糖体失活蛋白基因。并且CsRIP2与CsRIPI含有一个1713bp的ORF，有98%的序列一致，编码产物与CsRIP1具有96%的相似性。已克隆的CsRIP2的3，UTR与CsRIPI相比，缺失了一段15bp的序列。另外，根据上述实验方法，发现CsRIP1和CsRIP2基因的gDNA都不含内含子。

2.2 CsRIP基因编码产物的结构域分析和同源性比较

通过上述实验发现，CsRIP含有1个信号肽，由22个氨基酸残基组成，第22位的缬氨酸和第23位的半胱氨酸之间是切割点；并且CsRIPs含有1个RIP结构域，相当于II型RIP的A链；含有2个ricin结构域。相思子毒素-a和蓖麻毒素A链的N-糖苷酶活性中心裂隙中所有氨基酸残基均出现在CsRIPs的相应位置上，CsRIPs与樟的辛纳毒蛋白III前体、蓖麻毒素前体等具有较高的序列相似性。另外，蓖麻毒素、白果槲寄生的凝集素I等含有2个同源的RBL结构域，并且其具有3个谷氨酰胺-任意氨基酸-色氨酸重复基序。同时在对应位置上，都含有3个保守的QXW基序，且5个保守的氨基酸残疾组成了蓖麻毒素的2个碳水化合物结合位点，在CsRIPs的B链中，这2组氨基酸残基也高度保守。而CsRIPs的A链靠近C末端的位置上有1个半胱氨酸残疾，与其他的一样，B链上有9个。

2.3 CsRIP基因在不同组织中的表达分析

在茶树4种不同组织中，利用Real-time qRT-PDR技术检测CsRIP1和CsRIP2的表达模式，结果显示，在幼根、叶子等两者均有表达。CsRIP1叶子中的表达水平最高，CsRIP2在子叶中的表达水平最高。

2.4 CsRIP基因编码产物的系统进化树分析

以多基因家族的形式，该糖体失活蛋白存在于植物的基因组中。采用DNAMAN软件中的邻接法构建进化树。结果表明，茶树的2中RIPs与樟的RIPs聚为一支，同物种的RIPs首先聚类合并，蓖麻、荷兰鸢尾等的RIPs聚为一支，相思子和美丽相思子的RIPs聚为一支。

2.5 假眼小绿叶蝉和机械伤害处理对CsRIP基因表達的影响

实验表明，CsRIP1和CsRIP2表达在假眼小绿叶蝉取食3h后开始升高，取食48h后，两者的转录本水平大约分别是对照的120和100倍。机械伤害处理6h后，CsRIP1的表达达到最大值。处理4h后，再度增强。而在机械伤害处理6h后，CsRIP2表达水平升高，处理后48h，降至对照水平1/2。

3 结论与讨论

本研究从茶树中分裂出2个II型核糖体失活蛋白质基因，其编码570个氨基酸残基，并且都含有1个1713bp读码框。CsRIPI的5，和3，UTR等长度分别为73、224bp，CsRIP2与CsRIP1基因的3，UTR相比，缺失了一段15bp的核苷酸序列。在成熟的过程中，II型核糖体失活蛋白前体信号肽和连接肽被切除，通过1个二硫键A链和B链连接起来。II型RIPs的活性中心点保守的氨基酸残疾均出现在CsRIPsA链的相应位置上[2]。另外，A链发挥其酶学活性的关键因素是低水平的赖氨基酸残基，B链能够结合细胞表面寡糖链上的半乳糖残基，介导毒蛋白的内吞过程。通过实验发现，B链含有2个重复的结构域，因此，B链可能起源于一个编码40个氨基酸残基的基因。并且相同的结构模式和保守的氨基酸残基也存在与CsRIPs的B链上。

在已检测的4重组织中，尽管2个CsRIP基因都有所表达，但是也具有一定的组织特异性。本实验中，假眼小绿叶蝉取食快速诱导CsRIPs基因表达，机械伤害显著诱导CsRIPs基因的表达，但是结果表明CsRIPs已经发生亚功能化，可能参与茶树的防卫反应。并且根据系统进化树分析显示，可以设想在进化的过程中，昆虫取食的选择压力导致CsRIPs获得了叶片中表达，演变成了一种防卫蛋白，且受昆虫取食诱导的特性。

参考文献

[1]黄亚辉，张觉晚.茶树抗假眼小绿叶蝉的叶片解剖特征[J].茶叶科学，1998（1）：35-38.

[2]谢素霞，程琳，曾威，等.茶树HCT基因的克隆及表达[J].东北林业大学学报，2013（6）：19-22.

（责任编辑：赵中正）