二至天癸颗粒对小鼠卵细胞及胚胎质量的影响及其机制

李婷婷，连方，孙振高

(1山东中医药大学，济南 250355;2山东中医药大学附属医院)

二至天癸颗粒对小鼠卵细胞及胚胎质量的影响及其机制

李婷婷1，连方2，孙振高2

(1山东中医药大学，济南 250355;2山东中医药大学附属医院)

目的 探讨二至天癸颗粒提高小鼠卵细胞及胚胎质量的机制。方法 将180只7周龄雌性小鼠按随机数字表法分为三组各60例。二至天癸组予二至天癸颗粒加注射用尿促性素(HMG)超排卵；注射用绒毛膜促性素(HCG)组予HMG及HCG超排卵；空白组不干预。每组各30只取卵及颗粒细胞，解剖镜下观察卵母细胞形态，有极体排出计为MⅡ卵，计算优质卵率(MⅡ卵/获卵数)。剩余30只小鼠取胚胎行形态学观察，记录优质胚胎数、计算优质胚胎率。Western blotting法和RT-PCR法分别检测颗粒细胞FasL、Fas、Caspase8、Caspase3 mRNA及其蛋白表达；荧光素酶法检测MⅡ卵及胚胎ATP。分析FasL、Fas、Caspase8、Caspase3表达与MⅡ卵及胚胎平均ATP的相关性。结果 三组获卵数和MⅡ卵数比较，结果均为二至天癸组>HCG组>空白组，但二至天癸组与HCG组比较差异无统计学意义(P均>0.05)，两组与空白组比较差异均有统计学意义(P均<0.01)；三组优质卵率和MⅡ卵平均ATP含量比较，结果均为二至天癸组>空白组>HCG组，且二至天癸组明显高于HCG组(P<0.05)，但二至天癸组和空白组相比、空白组和HCG组比较差异均无统计学意义(P>均0.05)。三组胚胎数比较，二至天癸组>HCG组>空白组，但HCG组和空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)；优质胚胎数二至天癸组>空白组>HCG组，但三组间两两比较均无统计学差异(P均>0.05)；优质胚胎率和胚胎平均ATP空白组与二至天癸组比较无统计学差异(P>0.05)，两组均明显高于HCG组(P均<0.01)。二至天癸组Fas和Caspase3蛋白及mRNA表达均低于HCG组(P均<0.05)，与空白组比较无统计学差异(P均>0.05)；FasL蛋白及mRNA三组间表达比较均无统计学差异(P均>0.05)；二至天癸组Caspase8 mRNA与HCG组比较无统计学差异，但Caspase8蛋白表达低于HCG组(P>0.05)。Caspase3蛋白和mRNA的表达与MⅡ卵及胚胎平均ATP含量均呈负相关(P均<0.05)。结论 二至天癸颗粒可提高卵细胞质量和胚胎质量，其机制可能为下调颗粒细胞Fas、Caspase3表达。

二至天癸颗粒；颗粒细胞；Fas通路；小鼠

近几年辅助生殖技术飞速发展，但临床妊娠率始终较低，没有大的突破。2012年9月ESHRE公布欧洲国家体外授精-胚胎移植/卵胞浆内单精子显微注射技术(IVF/ICSI)成功率仅在30%左右[1]。随着自然环境和社会环境的变化，影响人类配子和受精卵质量的因素日趋增多而复杂，不孕症发病率也逐年增高。影响成功妊娠的因素较多，其中卵母细胞质量和胚胎发育潜能是关键因素之一。包绕着卵母细胞的颗粒细胞(以下称颗粒细胞)为卵巢的主要功能细胞之一，具有支持和营养卵母细胞的作用，是影响生殖功能的重要一环。二至天癸颗粒来源于山东中医药大学附属医院连方教授创立的补肾调冲之二至天癸方。多年来在临床上用于行IVF-ET的不孕症患者，临床及实验研究发现其能提高卵母细胞和胚胎质量，改善子宫内膜容受性，提高妊娠率。本研究探讨二至天癸颗粒提高大鼠卵细胞与胚胎质量的效果及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：同一时期出生的7周龄SPF级健康性成熟昆明种雌性小鼠180只(山东大学医学院实验动物中心提供)，体质量(35±5)g。动物质量合格许可证号：SCXK(鲁)20140004。适应性饲养1周后对雌鼠行阴道分泌物涂片检查确定动情周期，见大量卵圆角化细胞即确定为动情期，将连续观察到两个动情周期的小鼠纳入实验。实验药物：二至天癸颗粒，山东中医药大学附属医院制剂室提供[院内批号：(01)FZ032-03]，规格：3 g/包，12包/袋；组成：女贞子、旱莲草、菟丝子、枸杞子、当归、白芍、川芎、熟地黄、制香附、炙甘草。注射用尿促性素(HMG)、注射用绒毛膜促性素(HCG)均由丽珠集团丽珠制药厂生产。试剂与仪器：抗体均购自Bioworld公司，引物由上海汉尹生物科技有限公司设计合成，三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒为碧云天生物技术公司产品，编号S0026。

1.2 动物分组及干预 将符合实验标准的180只雌性小鼠随机分为二至天癸组、HCG组、空白组，各60只。采用人与动物的体表面积直接计算法[2]计算小鼠的每日用药量，小鼠每日服用二至天癸颗粒0.1 g相当一般成人的每日服药量。取一包二至天癸颗粒溶于7.5 mL蒸馏水，得0.4 g/mL混悬液，每日0.25 mL灌胃。注射用HMG 75 U溶于2.5 mL生理盐水中，每只小鼠每次取0.4 mL注射。注射用HCG 1 000 U溶于2.5 mL生理盐水中，取0.1 mL(40 U)加0.9 mL生理盐水，每次注射0.3 mL。每日下午16时雌鼠灌胃给药，二至天癸组用二至天癸颗粒，HCG组及空白组用等量蒸馏水，均连续10 天。第11天(下午16时)二至天癸组与HCG组同时腹腔注射HMG 10 IU，48 h后腹腔注射HCG 12 IU。

1.3 标本获取 每组各取半数小鼠，二至天癸组及HCG组于注射HCG后14 h、空白组于阴道上皮角化次日(对雌鼠行阴道分泌物涂片检查确定动情周期)断颈处死，剪取输卵管，收集卵丘复合物及颗粒细胞;选取MⅡ期卵细胞脱颗粒，分离颗粒细胞。每组剩余半数小鼠按照雌∶雄=1∶1提前两周准备8周龄雄性小鼠适应性饲养，于雌鼠注射HCG后分别合笼饲养，次日晨检栓，合笼40 h后同上法处死小鼠，解剖取出输卵管，TB 针冲洗一端，使受精卵从另一端流出，收集受精卵于含P-1液的四孔培养皿中进行形态学观察后放入培养箱待用。

1.4 相关指标观察 ①卵细胞、胚胎形态学变化：解剖镜下观察卵母细胞形态，有极体排出计为MⅡ卵，分装每只鼠所获的MⅡ卵，计算优质卵率(MⅡ卵/获卵数)。分装每只鼠所获胚胎，进行形态学观察，记录优质胚胎数、计算优质胚胎率。②颗粒细胞FasL、Fas、Caspase8、Caspase3表达：Western blotting法检测颗粒细胞FasL、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白的相对表达量；RT-PCR法检测颗粒细胞FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase8 mRNA、Caspase3 mRNA的相对表达量。③MⅡ卵及胚胎线粒体ATP含量：荧光素酶法检测MⅡ卵及胚胎线粒体ATP，按照试剂盒说明进行操作。

2 结果

因在动情周期观察、给药、标本留取及检测过程中均有小鼠被剔除，最终计入统计的为每组各40只。

2.1 三组卵及胚胎情况比较 见表1、2。

表1 三组卵基本情况比较±s)

注：与空白组比较，*P<0.05，△P<0.01；与HCG组比较，#P<0.01。

表2 三组胚胎基本情况比较±s)

注：与空白组比较，*P<0.05，△P<0.01；与HCG组比较，#P<0.01。

2.2 三组FasL、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白表达比较 见表3。

表3 三组FasL、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白

注：与空白组比较，*P<0.05，△P<0.01；与HCG组比较，#P<0.01。

2.3 三组FasL、Fas、Caspase8、Caspase3 mRNA表达比较 见表4。

表4 三组FasL、Fas、Caspase8、Caspase3 mRNA

注：与空白组比较，*P<0.05，△P<0.01；与HCG组比较，#P<0.05。

2.4 相关性分析 Caspase3蛋白和mRNA相对表达量与MⅡ卵ATP含量均呈负相关(r分别为-0.326和-0.266，P均<0.05)，与胚胎线粒体ATP含量亦均呈负相关(r分别为-0.398和-0.319，P均<0.05)；FasL、Fas、Caspase8蛋白和mRNA相对表达量与MⅡ卵ATP含量、胚胎线粒体ATP含量均无明显相关性(P均>0.05)。

3 讨论

卵母细胞和胚胎着床以前的发育有赖于能量的产生，线粒体内氧化磷酸化作用产生的ATP可反映卵母细胞和胚胎耗氧量，是整体代谢活性的评判指标。Tejera等[3]测定IVF治疗患者的卵母细胞耗氧率发现，能正常受精的卵母细胞较不受精或异常受精者具有更高的耗氧率，形成胚胎并成功着床的卵母细胞亦高于未着床者，提示在受精前单个卵母细胞的耗氧率可作为无创评估卵母细胞质量及其发育潜能的良好指标[4]。线粒体活性与数目较低的卵母细胞往往容易发生成熟障碍，受精失败以及胚胎发育能力低下[4～7]。本研究结果显示，MⅡ卵ATP含量二至天癸组>空白组>HCG组，二至天癸组明显高于HCG组；胚胎数二至天癸组>空白组>HCG组，但空白组和HCG组之间比较无明显统计学差异；优质胚胎数二至天癸组>空白组>HCG组，且组间比较均具有明显统计学差异；优质胚胎率和胚胎线粒体ATP含量二至天癸组>空白组>HCG组，但二至天癸组与空白组比较无明显统计学差异。可见二至天癸颗粒可以提高卵和胚胎的活性，从而提高卵细胞和胚胎质量，以利于受精和胚胎发育。

FasL/Fas-FADD-Caspase8-Caspase3为经典的凋亡通路，可介导多个器官内多种组织细胞凋亡。本研究结果表明，二至天癸组Fas和Caspase3 mRNA及其蛋白表达均明显低于HCG组，与空白组比较无统计学差异；FasL mRNA及其蛋白表达三组间比较均无统计学差异；二至天癸组Caspase8 mRNA表达与HCG组比较无统计学差异，但Caspase8蛋白表达明显低于HCG组。四个关键蛋白和mRNA的表达在三组的表达大致趋势是一致的，二至天癸组的表达低于HCG组，与空白组的表达水平大致相当。其组内的表达差异一是考虑个体差异，二是在信号转导的复杂通路中，蛋白可能受到上游下游多个蛋白的共同调控。说明某一蛋白表达上调或下调只能从一个侧面反映机体状况或药物作用，如需深入研究则应构建整个信号转导网络。这与中医整体观念的思路是一致的。

Caspase3是一种细胞内蛋白酶家族，在哺乳动物细胞的凋亡过程中起关键作用。目前己经发现了14种不同的Caspase分子，其中Caspase3是最为重要的最终效应Caspase分子[8]。在正常情况下体内的Caspase3蛋白酶以未活化的形式，即酶原形式存在[9,10]。Caspase3活化涉及到一系列上游Caspase级联反应，并受到多种细胞内小分子的调控，如凋亡抑制蛋白、Bcl-2家族蛋白、钙蛋白酶等。只有在上游Caspase作用下，Caspase3大、小亚基之间天冬氨酸残基发生水解，使两者的位置发生交换，形成异源四聚体的活化形式，才能执行细胞凋亡的发生[11～14]。本研究二至天癸组颗粒细胞Caspase3蛋白表达明显低于HCG组；颗粒细胞Caspase3表达与MⅡ卵和胚胎线粒体ATP含量具有相关性。推测Caspase3可能为最终效应分子，与卵细胞和胚胎质量的相关性关系密切。综上所述，二至天癸颗粒可提高卵细胞和胚胎质量。其机制可能与下调颗粒细胞Fas通路Fas、Caspase3表达有关。颗粒细胞Caspase3表达作为卵细胞质量评估和胚胎选择的客观指标之一。

[1] Ferraretti AP, GoossensV, de Mouzon J, et al. Assisted reproductive technology in Europe,2008: results generated from European registers by ESHRE[J].Hum Reprod, 2012,27(9):2571-2584.

[2] 苗明三.实验动物和动物实验技术[M].北京:中国中医药出版社,2003:143-144.

[3] Tejera A, Herrero J, de Los Santos MJ, et al. Oxygen consumption is a quality marker for human oocyte competence conditioned by ovarian stimulation regimens[J]. Fertil Steril, 2011,96(3):618-623.

[4] 黄颖,于洋,乔杰.卵母细胞质量评估研究进展[J].国际生殖健康/计划生育杂志,2014,33(4):301-305.

[5] VanBlerkom J. Mitochondria in human oogenesis and preimplantationembryogenesis: engines of metabolism,ionic regulation and developmental competence[J]. Reproduction, 2004,128(3):269-280.

[6] Dumollard R, Ward Z, Carroll J, et al. Regulation of redox metabolism in the mouse oocyte and embryo[J]. Development, 2007,134(3):455-465.

[7] 羊海涛,覃爱平,靳玉甫,等.体外受精-胚胎移植妇女体内颗粒细胞线粒体活性和左旋肉碱水平的关系[J].中国现代医学杂志,2014,24(28):31-34.

[8] Fan T, Han LH, Cong RS, et al. Caspase family proteases and apoptosis[J]. ActaBiochimBiophys Sin (Shanghai), 2005,37(11):719-727.

[9] Shi Y. Caspase activation, inhibition, and reactivation: a mechanistic view[J]. Protein Science, 2004,13(8):1979-1987.

[10] Fadeel B, Orrenius S. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in human disease[J]. J Intern Med, 2005,258(6):479-517.

[11] Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis[J]. Nature, 2000,407(6805):770-776.

[12] Riedl SJ,Shi Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2004,5(11):897-907.

[13] 岳原亦,张扬,张一奇.Caspase家族与细胞凋亡[J].中国医疗前沿,2011,6(6):25-26.

[14] 柴继杰,施一公.凋亡小体与炎症小体:Caspase蛋白酶的激活平台[J].生物化学与生物物理进展,2014,41(10):1056-1062.

国家自然科学基金资助项目(81473720)。

连方(E-mail： f_lian@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.011

R321.1

A

1002-266X(2017)04-0037-03

2016-03-20)