半导体激光局部照射对SD大鼠缺血皮瓣愈合时ICAM-1和MCP-1表达的影响

聂芳菲 杨清默 夏有辰 马建勋 陈东明

(北京大学第三医院成形外科，北京 100083)

·实验研究·

半导体激光局部照射对SD大鼠缺血皮瓣愈合时ICAM-1和MCP-1表达的影响

聂芳菲 杨清默①夏有辰*马建勋 陈东明

(北京大学第三医院成形外科，北京 100083)

目的 观察半导体激光局部照射SD大鼠缺血皮瓣创面愈合时组织中炎症反应因子细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的表达，探讨其促进缺血皮瓣愈合的机制。 方法 在20只雄性SD大鼠背部两侧对称各制备2个皮瓣，蒂位于尾侧，长6 cm，宽1 cm，2个皮瓣间距离2 cm。实验侧(实验组)皮瓣术后行半导体激光照射，每天1次，连续照射数天直至取材，同时遮挡对照侧(对照组)。采用自身对照法比较实验组和对照组的创面愈合情况和皮瓣存活面积，分别于术后4、7、10、14 d取皮瓣中段组织进行病理学染色，分析制备的大鼠皮瓣血管形成情况和炎症反应因子ICAM-1和MCP-1的表达。 结果 皮瓣远端发生明显的缺血坏死。术后7 d，实验组和对照组的皮瓣存活率分别为(84.6±10.8)%和(79.8±11.3)%，实验组皮瓣存活率明显高于对照组(n=5，t=7.299，P=0.002)。术后4、7、10、14 d实验组微血管密度分别为(74.160±25.968)、(115.937±17.827)、(87.330±21.383)、(69.644±12.126)个/mm2，均明显高于对照组(33.460±8.310)个/mm2(t=3.089，P=0.037)、(36.685±7.693)个/mm2(t=11.741，P=0.000)、(43.474±7.400)个/mm2(t=4.185，P=0.014)、37.104±8.721(t=5.218，P=0.006)。术后4 d实验组炎症因子ICAM-1的表达量0.063±0.015明显高于对照组0.045±0.017(t=8.430，P=0.001)；术后7 d实验组炎症因子ICAM-1和MCP-1的表达量分别为0.022±0.008、0.041±0.008，均明显低于对照组0.042±0.015(t=4.309，P=0.013)、0.065±0.007(t=6.731，P=0.003)。 结论 半导体激光局部照射SD大鼠缺血皮瓣能调节创面愈合时炎症因子ICAM-1和MCP-1的表达，是促进缺血皮瓣愈合的重要机制之一。

半导体激光； 缺血皮瓣； 炎症； 单核细胞趋化蛋白-1; 细胞间黏附分子-1

皮瓣移植是整形外科最基本的治疗手段，如果皮瓣的长宽比过大，由于皮瓣本身的血管痉挛、感染、过氧化损伤、血栓形成等会导致皮瓣缺血坏死，影响组织的修复。目前，术后皮瓣的缺血坏死仍然是一个非常棘手的问题。2013年Cury等[1]研究表明低能量激光照射对大鼠缺血性皮瓣的血管再生有促进作用，提示低能量物理因素的干预在微创甚至无创的情况下可能有利于促进皮瓣成活的效果。尽管已对低能量激光(包括氦氖激光和半导体激光等)进行了大量的实验研究，并且在创面愈合、类风湿性关节炎、口腔疾病等治疗领域取得肯定的疗效，但其作用机制尚未完全明确[2]。有关半导体激光照射促进缺血皮瓣成活的炎症相关机制的报道也不多。为研究半导体激光促进缺血皮瓣远端缺血组织愈合的机制，本实验设计了长宽比为6∶1的超长随意型皮瓣，成功制备皮瓣远端缺血的动物模型，并比较该模型近端和远端组织的创面愈合情况，观察炎症因子细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)在其中的表达情况，为探讨半导体激光调节创面局部炎症反应，促进缺血皮瓣创面愈合的机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

健康雄性SD大鼠20只[北京大学医学部实验动物中心提供，许可证号：SYXK(京)2011-0039]，体重350～400 g。羊抗鼠ICAM-1多克隆抗体、羊抗鼠MCP-1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组化试剂盒PV9003购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 动物模型的制备

3%戊巴比妥钠0.15 ml/100 g体重腹腔内麻醉，背部备皮。以中线为界，在大鼠背部设计皮瓣，蒂位于尾部双侧髂棘连线上，长6 cm，宽1 cm。大鼠俯卧位固定于手术台上，常规消毒，铺巾，切开皮瓣掀起至筋膜层，切断皮瓣与下方肌肉层的筋膜连接，使皮瓣与基底无连接，仅留1 cm宽的蒂，5-0带针线原位缝合皮瓣(图1)，无菌敷料覆盖，固定，术后单笼饲养。

1.3 照射方案

镓铝砷(GaAlAs)半导体激光治疗机(北京三顿医疗设备有限公司，SUNDOM-300IB型)，波长810 nm，功率900 mW，每天1次，每次6 min，连续照射，能量密度为21.6 J/cm2。采用自身对照实验设计，按照随机序号确定照射侧，照射范围覆盖单侧皮瓣，其余部位用不锈钢板遮挡，不行激光照射。

1.4 标本采集与组织学染色

术后4、7、10、14 d取材，每个时间点5只。分别取每个皮瓣中部，面积为1 cm×0.5 cm的全层皮肤组织，固定于4%多聚甲醛。常规石蜡包埋，切片厚度5 μm。

HE染色显示组织的基本结构和形态，计数微血管密度：参照Weidner校正法计数微血管，在放大400倍的条件下，每例样本检测10个的视野，涵盖真皮全层，分别记录血管数，按血管数/高倍镜视野面积(0.24 mm2)进行计数分析[3]。免疫组化染色显示目的分子ICAM-1和MCP-1的表达部位，采用Image-Pro 6.0软件进行阳性染色信号采集分析，在放大400倍的条件下，每例样本采集10个视野，计算其阳性信号的平均光密度(optical density,OD)值。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 大体观察

术后1 d皮瓣远端开始出现颜色加深、变黑，与皮瓣近端界限较模糊，触之质地稍硬，皮温低，未完全坏死。第3天起，坏死部位基本确定，与近端皮瓣分界清楚，边界不再扩大，颜色加深，发硬，收缩，与周围皮肤稍分离，皮瓣坏死部位形成结痂(图2)。大约术后第14天，结痂开始脱落，露出皮下瘢痕组织。

取大鼠术后7 d皮瓣图像，坏死部位固定后，应用Image-pro6.0软件计算坏死面积。皮瓣存活率=皮瓣存活表面积/皮瓣总面积×100%，实验组(84.6±10.8)%，对照组(79.8±11.3)%，实验组皮瓣存活率明显高于对照组(n=5，t=7.299，P=0.002)。

2.2 组织学观察及分析

与对照组相比，实验组缺血皮瓣术后第4天有明显的炎症细胞浸润，术后第7天炎症细胞浸润明显减轻，术后14 d组织结构清晰，皮下血管较丰富，炎症细胞少见，皮肌层肌纤维排列较好。镜下观察计数，在4个时间点实验组微血管密度均明显高于对照组，差异有统计学意义(表1)。

2.3 ICAM-1

术后4 d在实验组ICAM-1的表达量明显高于对照组；术后7 d 实验组ICAM-1的表达量明显低于对照组。在创面修复的晚期(术后10、14 d)，2组ICAM-1的表达量未见明显差异(图3，表2)。

2.4 MCP-1

术后4 d实验组MCP-1的表达量略高于对照组，但差异无统计学意义；术后7 d实验组MCP-1的表达量明显低于对照组，差异有统计学意义。在创面修复的晚期(术后10、14 d)，2组MCP-1的表达量未见明显差异(图4，表3)。

个/ mm2

OD/μm2

OD/μm2

图1 大鼠背部缺血皮瓣模型的制备。以中线为界，在大鼠背部设计皮瓣，蒂位于尾部双侧髂棘连线上，长6 cm，宽1 cm，切开皮瓣，原位缝合 图2 大鼠缺血皮瓣模型术后大体观察(未照射侧)。A. 术后1 d皮瓣远端开始出现颜色加深、变黑，与皮瓣近端界限较模糊；B. 术后3 d坏死部位基本确定，与近端皮瓣分界清楚 图3 大鼠皮瓣ICAM-1的免疫组化染色，苏木素复染，棕黄色为阳性信号。A、B. 术后4 d对照组与实验组，ICAM-1在实验组的表达量明显高于对照组；C、D. 术后7 d对照组与实验组，ICAM-1在实验组的表达量明显低于对照组；E、F. 术后10 d对照组与实验组，2组的表达量未见明显差异 ×100 图4 大鼠皮瓣MCP-1的免疫组化染色，苏木素复染，棕黄色为阳性信号。A、B. 术后4 d对照组与实验组，MCP-1在实验组的表达量略高于对照组；C、D. 术后7 d对照组与实验组， MCP-1在实验组的表达量明显低于对照组；E、F. 术后10 d对照组与实验组，2组的表达量未见明显差异 ×100

3 讨论

临床研究[2，4]表明低能量激光照射对糖尿病足、静脉溃疡创面、急性擦伤创面等均有一定的治疗作用。动物实验提示机制可能是低能量激光可活化某些信号传导通路，从而调节(增加或减少)多种细胞因子和生长因子水平，进而间接作用于创面，促进其愈合[2，5，6]。19～24 J/cm2的低能量激光效应高于能量密度设定在8.25 J/cm2以下及130 J/cm2以上的治疗效应[7]。本研究选择21.6 J/cm2的能量密度用于促进缺血皮瓣的创伤愈合。

本实验设计长宽比为6∶1的超长随意型皮瓣，观察其远端坏死情况，并行组织病理学检查，分析制备的大鼠皮瓣血管形成情况及炎症相关信号分子的表达情况，结果成功制备了远端缺血坏死的大鼠背部缺血皮瓣模型。

血液循环障碍被认为是皮瓣坏死的主要原因，本研究结果表明局部照射低能量激光可以增加局部皮肤的微血管密度，术后14 d内与对照组差异均有统计学意义，提示促进局部微血管形成是其作用机制之一，与Cury等[1]报道相似。弱激光还可能具有调节炎症介导因子的作用[6]，从而起到促进创面愈合，促进缺血皮瓣存活的效应。

ICAM是免疫球蛋白超家族的成员之一，内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞和上皮细胞等均可表达ICAM-1，促炎因子能促进其表达。ICAM-1不仅是一个白细胞黏附分子，而且通过促进内皮细胞激活直接参与炎症反应[8,9]。ICAM-1在增生的血管内皮细胞中表达最强，而血管内皮细胞、血管生长因子及细胞外基质是调节血管生成的3个重要因素，因此，ICAM-1促进白细胞与内皮细胞之间的黏附可能是诱导血管生成的起始事件[10]。本研究结果表明，半导体激光照射能明显升高缺血皮瓣术后4 d ICAM-1的表达，7 d时抑制其表达，证实半导体激光照射具有缩短炎症反应期，促进伤后早期血管生成，促进创面愈合的作用。

MCP-1属于一种前炎症因子，可诱导内皮细胞和单核细胞表达黏附因子，促使炎性细胞向病变部位聚集，扩大炎症反应。其主要功能是激活和趋化单核细胞，在炎症性疾病和新生血管形成及其损伤修复中发挥重要作用[11]。研究[12，13]表明MCP-1在正常创面伤后1 d即可迅速达到高峰然后逐渐下降至伤前水平。本研究结果显示，术后4 d实验组表达水平略高于对照组，但差异无统计学意义，可能与本实验未能检测更早的时间点有关；术后7 d实验组的表达量明显低于对照组，提示在缺血皮瓣术后的适当时机有效控制炎性反应，减少炎性反应因子、趋化因子和黏附因子的表达对于皮瓣的愈合具有重要的意义。

总之，本研究证实低能量激光在大鼠创面愈合的早期通过促进血管新生，促进创面炎症反应提早启动并进而提早创面修复过程，而后又在一定程度上抑制炎症相关因子ICAM-1和MCP-1的表达，抑制炎症反应，进而加速创面愈合的作用。诚然，创面愈合过程中，炎症细胞及炎症因子的调控网络错综复杂，要证明低能量激光促进缺血皮瓣创面愈合的确切机制仍需要深入研究探讨。

1 Cury V, Moretti AI, Assis L, et al. Low level laser therapy increases angiogenesis in a model of ischemic skin flap in rats mediated by VEGF, HIF-1α and MMP-2. J Photochem Photobiol B,2013,125(4):164-170.

2 毛和水, 姚 敏, 方 勇.弱激光疗法在创面愈合中的作用研究进展.中华烧伤杂志, 2012, 28(6):462-467.

3 张淼丽.如何计算显微镜下视野面积.诊断病理学杂志,2009,16(1):79.

4 相 英.半导体激光治疗老年人压疮疗效观察.上海医药,2016,37(2):26-27.

5 段 强, 王冰水, 牟 翔,等.低功率氦氖激光对小鼠烫伤创面血管内皮细胞因子和细胞凋亡因子基因表达的影响.中国康复医学杂志,2016,31(2)：199-200，214.

6 段 强, 王冰水, 单守勤,等.低强度激光照射对小鼠烫伤创面转化生长因子-β1和白细胞介素-1β基因表达的影响.中华物理医学与康复杂志,2015,37(3)：176-178.

7 Hoffman M, Monroe DM. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regen,2012, 20(5):770-777.

8 Wolf SI, Howat S, Abraham DJ, et al. Agonistic anti-ICAM-1 antibodies in scleroderma: Activation of endothelial pro-inflammatory cascades. Vascul Pharmacol, 2013, 59(1-2):19-26.

9 Liu G, Place AT, Chen Z, et al. ICAM-1-activated Src and eNOS signaling increase endothelial cell surface PECAM-1 adhesivity and neutrophil transmigration. Blood,2012, 120(9):1942-1952.

10 宋宜慧, 黄 熙.细胞间黏附分子-1与血管生成的研究进展.免疫学杂志, 2012,28(6):530-533.

11 贾志刚, 方 勇, 姚 敏, 等.神经肽P 物质诱导高糖条件下人皮肤成纤维细胞分泌MCP-1 的分子机制.上海交通大学学报(医学版),2012,32(10): 1302-1306.

12 顾 钏, 方 勇, 倪 涛,等.糖尿病小鼠创面愈合过程中两种趋化因子的表达.中华烧伤杂志, 2008, 24(3):221-222.

13 彭银波, 卢化祥, 姚 敏,等.MCP-1对糖尿病小鼠创面愈合的促进作用.上海交通大学学报:医学版,2013,33(12):1583-1586,1590.

(修回日期：2016-12-22)

(责任编辑：李贺琼)

Effects of Semiconductor Laser Local Irradiation on Expression of ICAM-1 and MCP-1 During the Healing of Ischemic Skin Flaps in Sprague-Dawley Rats

NieFangfei*,YangQingmo,XiaYouchen*,etal.

*DepartmentofPlasticSurgery,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100083,China

XiaYouchen,E-mail:xiayouchen@sohu.com

Objective To study the mechanism of semiconductor laser local irradiation in promoting the healing of ischemic skin flap in Sprague-Dawley(SD) rats by investigating the expression of inflammatory factors of intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1). Methods Two symmetrical skin flaps were prepared at the back of a male SD rat with the pedicles located on the tail. Each flap was 6 cm in length and 1 cm in width, and the distance between the two flaps was 2 cm. One flap was treated with semiconductor laser local irradiation (once daily until specimen collection) and the other side was the control side. The self-control method was used to compare the differences between the two flaps. The survival area of flap, the vascular formation and the expressions of inflammation related molecules ICAM-1 and MCP-1 were detected respectively on the postoperative 4, 7, 10, and 14 d. Results The distal end of the skin flaps had obvious ischemic necrosis. The survival rate of flap and the microvascular density in the experimental group were significantly higher than those in the control group after the operation. On the 7th day, the survival rates of flaps in the experimental group and the control group were (84.6±10.8)% and (79.8±11.3)%, respectively. On the 4th, 7th, 10th, and 14th days, the microvessel densities (per mm2) of the experimental group (74.160±25.968, 115.937±17.827, 87.330±21.383, and 69.644±12.126) were significantly higher than those of the control group (33.460±8.310,t=3.089,P=0.037; 36.685±7.693,t=11.741,P=0.000; 43.474±7.400,t=4.185,P=0.014; 37.104±8.721,t=5.218,P=0.006). On the 4th day after operation, the expression of ICAM-1 in the experimental group (0.063±0.015) was significantly higher than that in the control group (0.045±0.017,t=8.430,P=0.001), while on the 7th day after operation, the expressions of inflammatory cytokines of ICAM-1 and MCP-1 in the experimental group (0.022±0.008 and 0.041±0.008) were significantly lower than those in the control group (0.042±0.015,t=4.309,P=0.013; 0.065±0.007,t=6.731,P=0.003). Conclusions The expression of inflammatory factors of MCP-1 and ICAM-1 during the healing of ischemic skin flap in SD rats can be regulated by semiconductor laser irradiation. This is an important mechanism to promote the healing of ischemic skin flap.

Semiconductor laser; Ischemic skin flap; Inflammation; Monocyte chemotactic protein-1; Intercellurlar cell adhesion molecule-1

，E-mail：xiayouchen@sohu.com

A

1009-6604(2017)02-0166-05

10.3969/j.issn.1009-6604.2017.02.017

2016-06-15)

①(厦门大学附属第一医院乳腺外科，厦门 361003)