3，4-二羟基扁桃酸在大肠杆菌中的生物合成

李晓林周威庄以彬路福平殷华（. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457；. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津300308）

3，4-二羟基扁桃酸在大肠杆菌中的生物合成

李晓林1，2周威2庄以彬2路福平1殷华2
（1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津300308）

3，4-二羟基扁桃酸是许多药物和香料合成的重要中间体，具有较强的抗氧化和清除自由基的活性。旨在实现3，4-二羟基扁桃酸在大肠杆菌中的从头合成。通过在大肠杆菌MG1655/ΔA中过表达来源于天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）的对羟基扁桃酸合酶（HmaS）和大肠杆菌的羟化酶（HpaBC）基因，实现了以葡萄糖为原料生物合成3，4-二羟基扁桃酸；并经IPTG和蛋白诱导温度初步优化后，摇瓶发酵36 h 3，4-二羟基扁桃酸的产量达到240 mg/L。

大肠杆菌；3，4-二羟基扁桃酸；生物合成；对羟基扁桃酸合酶（HmaS）；羟化酶（HpaBC）

3，4-二羟基扁桃酸，英文名3，4-Dihydroxymandelic acid（DHMA），是多种医药（如磺胺增效剂3，4，5-三甲氧基嘧啶，TMP）、香料（如香草基杏仁酸、香兰素）合成的重要中间体［1-3］，其本身也是一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂，如DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）自由基清除实验结果表明其自由基清除活性是维生素C、维生素E、抗氧剂264（butylated hydroxytoluene）的4倍［4］。目前，3，4-二羟基扁桃酸主要通过化学方法来合成，如以邻苯二酚与乙醛酸为原料，在碱性条件下缩合而实现合成［2，5］。然而，这种化学合成的方法收率低，产生大量的碱性废液，造成环境污染。利用微生物合成的方法将有效避免化学合成中复杂条件的控制以及环境污染等问题，因而受到越来越多研究人员的关注。大肠杆菌由于其遗传背景清晰，遗传操作技术简单，易于大规模化液体发酵生产，作为天然化合物的异源合成宿主越来越受到重视。近年来，许多来源于酪氨酸合成途径的芳香族衍生物，如咖啡酸、没食子酸、黑色素、丹参素、羟基酪醇等已实现了在大肠杆菌中的生物合成［6-8］，3，4-二羟基扁桃酸在微生物中异源生物合成方法尚未见报道。对羟基扁桃酸合酶（HmaS）基因存在于万古霉素类抗生素生物合成基因簇中，是一种Fe2+依赖型的双加氧酶，能将对羟基苯丙酮酸苄基脱羧和羟基化生成对羟基扁桃酸［9-12］。来源于大肠杆菌的羟化酶（HpaBC）被报道是一个双组份的单氧化酶，具有较大的底物宽泛性，能催化单羟基酚和二羟基酚类化合物苯环发生羟化反应，如催化对羟基苯乙酸、苯酚、酪氨酸（tyrosine）及香豆酸（coumanic acid）等底物［13，14］。本研究以本实验室构建的酪氨酸高产的大肠杆菌为出发菌株，引入来源于天蓝色链霉菌M145（Streptomyces coelicolor）的对羟基扁桃酸合酶（HmaS）和大肠杆菌的羟化酶（HpaBC），催化酪氨酸合成中间体对羟基苯丙酮酸（4HPP）合成3，4-二羟基扁桃酸，所构建的合成途径如图1所示。

图1 3，4-二羟基扁桃酸合成途径

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）、MG1655，天蓝色链霉菌M145（S. coelicolor）和质粒pTrcHisB均为本实验室保存。其中pTrcHisB质粒中trc启动子是trp启动子和lac启动子拼合的强启动子，受lacI阻遏蛋白调控，需要IPTG诱导启动转录。

1.1.2 试剂及培养基 Phusion超保真DNA聚合酶购自New England Biolabs 公司；限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ购自Fermentas公司；T4连接酶购自TaKaRa Biotechnology公司；3，4-二羟基扁桃酸标准品购自天津希恩思生化科技有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自北京索莱宝生物科技有限公司。

LB培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠 10 g/L；M9培养基：磷酸氢二钠12.8 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，氯化钠 0.5 g/L，氯化铵1 g/L，葡萄糖2 g/L，硫酸镁0.24 g/L，氯化钙11.1 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 基因扩增 hpaBC（GenBank：AM946981.2）扩增：以E. coli BL21基因组DNA为模板，hpaBCF-BamHI和hpaBC-R-EcoRI为引物，进行PCR扩增。hpaBC-F-BamHI：5'-CGCGGATCCCATGAAACCAGA AGATTTC-3'（下划线为BamH I酶切位点），hpaBCR-EcoRI：5'-CCGGAATTCTTAAATCGCAGCTTCCAT TTC-3'（下划线为EcoR I酶切位点）；PCR参数：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，共30个循环；72℃ 10 min。凝胶电泳回收目的片段。

hmaS（GenBank：AJ223998.1）扩增：甘油保存的天蓝色链霉菌孢子稀释10-3，取100 μL稀释液涂于MS固体培养基，28℃培养48 h。收集菌丝于40 μL DMSO中，并放置-80℃冰箱进行简单冻融，作为PCR模板；PCR引物为hmaS-F-EcoRI：5'-CC GGAATTCaagaggtataggatcccATGCCGCCCAGTGACA TC-3'（下划线为EcoR I酶切位点，小写字母为核糖体识别位点RBS区），hmaS-R-HindIII：5'-CCCA AGCTTTCATCGGCCGGCCACTTC-3'（下划线为Hind III酶切位点）；PCR参数：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 10 min。凝胶电泳回收目的片段。

1.2.2 质粒及重组菌构建 以限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对pTrcHisB质粒和hpaBC分别进行酶切；通过凝胶电泳回收载体及基因片段；以载体与基因片段摩尔数比为1∶3进行连接，转化大肠杆菌DH5α，获得质粒pTrcHisB-hpaBC。然后用限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶对pTrcHisB-hpaBC和带RBS的hmaS PCR片段进行酶切、连接，转化至大肠杆菌DH5α，获得质粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS，其中hpaBC与 hmaS在PTrc启动子调控下共转录。转化质粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS至MG1655/ΔA，获得重组菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS。MG1655/ΔA［15］是本实验室在大肠杆菌E. coli K-12 MG1655的基因组中敲除了tyrR、pykA、pykF及pheA四个基因的突变株［16，17］，以增强前体4HPP的合成。

1.2.3 重组菌发酵培养 挑取MG1655/ΔA/pTrc-BCS菌株单克隆于5 mL液体LB中，37℃培养12 h；按体积比为1∶50 转接至50 mL液体LB中，37℃培养至OD600为0.6，加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG于30℃进行蛋白诱导，蛋白诱导时间为12 h；4 000 r/min离心10 min，收集菌体，加入50 mL M9发酵培养基（含葡萄糖2%）进行重悬，然后于30℃继续培养，24 h后取样测定3，4-二羟基扁桃酸产量。

1.2.4 3，4-二羟基扁桃酸HPLC、LC-MS分析鉴定 取发酵液1 mL，12 000 r/min离心10 min，收集上清。HPLC检测系统是岛津液相色谱仪；检测条件为：HPLC流动相A = 水（含0.1%甲酸），B=甲醇；流速= 1 mL/min，溶液配比为等浓度梯度，洗脱条件：0-15 min 2% B，16-30 min 2% B到100% B；进样量30 μL；液相色谱柱为 Agela Innoval MP C18柱（4.6×250 mm）；UV检测波长为254 nm。

LC-MS检测：配有紫外检测器的安捷伦1260系统和配有ESI离子源探针的bruker microQ-TOFⅡ质谱仪，检测条件包括：Agela Innoval MP C18柱（4.6×250 mm）；UV检测波长为254 nm；流动相A=水（含0.1%甲酸），B=甲醇；流速= 1 mL/min，溶液配比为等浓度梯度，洗脱条件：0-15 min 2 % B，16-30 min 2% B 到100% B；进样量20 μL；ESI负离子源，分子量扫描范围50-800。

1.2.5 3，4-二羟基扁桃酸标准曲线制作 配制浓度为10 mg/mL 3，4-二羟基扁桃酸母液，即称取3，4-二羟基扁桃酸10 mg，加入蒸馏水至终体积为1 mL。分别取5、1、15和20 μL 3，4-二羟基扁桃酸母液，加入蒸馏水至终体积为1 mL，配制成浓度为50、 100、150和200 mg/L的标准液。取30 μL各浓度标准液进行HPLC检测，制作3，4-二羟基扁桃酸浓度与峰面积的标准曲线。

1.2.6 发酵条件优化及液体发酵产量变化 蛋白诱导温度优化：按上述培养方法进行发酵培养，其中蛋白诱导温度分别设置16℃、30℃和37℃；IPTG浓度优化：按以上培养方法进行发酵培养，其中IPTG终浓度分别0.1、0.5和1 mmol/L；以优化后的条件进行培养，培养过程中一定时间取样，用于测定菌体生长量、底物葡萄糖消耗及3，4-二羟基扁桃酸产量随发酵时间的变化。其中菌体生物量测定发酵液OD600，葡萄糖浓度用生物传感分析仪（SBA-40E）测定，3，4-二羟基扁桃酸浓度测定通过HPLC的峰面积及标准曲线方程计算。各设3个处理。

2 结果

2.1 载体pTrcHisB-hpaBC-hmaS的构建及验证

扩增得到hmaS及hpaBC片段大小分别为1.1 kb和2.1 kb（图2-A）。重组载体pTrcHisB-hpaBC-hmaS用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切验证，得到大小为1.1、2.1和4.4 kb三条带（图2-B），与理论大小一致，并送金唯智测序公司进行了DNA测序验证。质粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS如图2-C所示。

图2 载体pTrcHisB-hpaBC-hmaS构建

2.2 3，4-二羟基扁桃酸重组菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的构建

MG1655/ΔA是本实验室构建的MG1655敲除株，破坏了酪氨酸合成途径的负调基因和竞争途径基因如tyrR、pheA、pykA和pykF。将载体pTrcHisB-hpaBC-hmaS转化至MG1655/ΔA，获得3，4-二羟基扁桃酸重组菌株MG1655/ΔA/pTrc-BCS。

2.3 发酵液中3，4-二羟基扁桃酸HPLC检测及LC-MS鉴定

对重组菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS进行液体发酵培养，取24 h的发酵液进行HPLC检测结果（图3）显示，在7.6 min处有新化合物的产生，与3，4-二羟基扁桃酸标准品的峰保留时间（Rt）一致。3，4-二羟基扁桃酸分子量为184，LC-MS检测结果显示7.6 min 峰的［M-H］-= 183，［2M-H］-= 367，确定该峰对应的化合物为3，4-二羟基扁桃酸。

图3 重组菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS发酵液HPLC检测及LC-MS结果

2.4 蛋白诱导温度和诱导剂IPTG对产量的影响

为进一步提高3，4-二羟基扁桃酸的产量，本研究对蛋白诱导温度、IPTG浓度进行了优化筛选。根据3，4-二羟基扁桃酸标准曲线方程计算产量，y=0.000 100 696x+33.967 1（r2=0.999 01），其中x为峰面积，y为样品浓度。结果（图4）表明，蛋白诱导温度为16℃时，3，4-二羟基扁桃酸的产量最高，是30℃的1.3倍，是37℃的2倍；在蛋白诱导温度为16℃，发酵时间为24 h等相同条件下，在IPTG浓度为0.5 mmol/L时，3，4-二羟基扁桃酸的产量最高为207 mg/L。

HmaS及HpaBC蛋白表达情况如图5所示。16℃诱导的菌体进行总蛋白和菌体超声破碎后，取上清蛋白进行了SDS-PAGE电泳。目的蛋白HpaBC（HpaB分子量为58.8 kD，HpaC分子量为18.5 kD）和HmaS（分子量为38.6 kD）在总蛋白和上清蛋白中的表达无明显差异，HpaBC的两个组分条带较为明显，hmaS基因在大肠杆菌中的蛋白表达量很低，在电泳图中显示不明显，推测可能其来源于链霉菌，GC含量较高，影响了蛋白表达量。

2.5 重组菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的发酵试验

重组菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS摇瓶发酵，蛋白诱导温度为16℃，IPTG浓度为0.5 mmol/L，在发酵0、2.5、4.5、6、12、24、36、48和60 h进行取样，测定菌体生长密度（OD600）、底物葡萄糖的消耗量及产物3，4-二羟基扁桃酸生成量。结果（图6）显示，发酵4.5-36 h，菌体快速生长，葡萄糖的消耗逐渐增加，3，4-二羟基扁桃酸产量快速增加，至36 h时3，4-二羟基扁桃酸产量达到240 mg/L，葡萄糖总消耗量为14.7 g/L。在36 h菌体生长开始进入稳定期，葡萄糖消耗速率减慢，3，4-二羟基扁桃酸的产量趋于稳定。

图4 DHMA发酵条件初步优化

图5 蛋白SDS-PAGE电泳图

图6 重组菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS菌株生长、底物葡萄糖消耗以及DHMA产量曲线

3 讨论

本研究在菌株MG1655/ΔA中成功实现对羟基扁桃酸合酶（HmaS）和4-羟基苯丙酮酸3-羟化酶（HpaBC）基因的表达，实现了在大肠杆菌中以葡萄糖为原料生物合成3，4-二羟基扁桃酸，并初步确定了合适的蛋白诱导的条件，即蛋白诱导温度为16℃、IPTG的浓度为0.5 mmol/L，使3，4-二羟基扁桃酸的产量达到240 mg/L，首次实现3，4-二羟基扁桃酸在微生物中的异源生物合成。

本研究中，把表达质粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS转化至MG1655，发酵结果显示，3，4-二羟基扁桃酸产量仅为10 mg/L左右（数据未显示）。推测野生株MG1655的4HPP的合成量低可能是影响3，4-二羟基扁桃酸产量的重要因素。为了增强前体的合成，实验选用了本实验室构建的菌株MG1655/ΔA，在MG655基因组上敲除了4个基因——tyrR、pykA、pykF及pheA。tyrR是芳香族氨基酸合成的负调控基因，敲除后会解除前体合成途径的负调控。pheA敲除阻断了竞争途径苯丙氨酸的合成，促使分支酸积累，分支酸在酶促作用下合成4HPP。敲除pykA、pykF基因，可促使PEP生成更多的莽草酸合成前体DAHP（3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸），增强前体4HPP合成。通过提高前体的合成，重组菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的3，4-二羟基扁桃酸产量提高到野生株中的20多倍。

本研究中所用hmaS基因DNA序列为直接从链霉菌中PCR获得，并没有进行密码子优化，其在大肠杆菌中蛋白表达量较低，亦可能是影响3，4-二羟基扁桃酸的重要因素之一，进一步的工作中可以对DNA序列进行密码子优化，提高3，4-二羟基扁桃酸产量。另外3，4-二羟基扁桃酸生物合成与酪氨酸的生物合成有共同的前体——对羟基苯丙酮酸（4HPP），4HPP可以在细胞内酪氨酸氨基转移酶（TyrB）催化下生成酪氨酸［18，19］，因而酪氨酸与3，4-二羟基扁桃酸的合成之间存在前体竞争，敲除酪氨酸氨基转移酶（TyrB）基因阻断酪氨酸的合成，有可能进一步提高3，4-二羟基扁桃酸产量。

4 结论

本研究在大肠杆菌MG1655/ΔA中构建了3，4-二羟基扁桃酸生物合成途径，实现了以葡萄糖为原料生物合成3，4-二羟基扁桃酸。

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（责任编辑 马鑫）

Biosynthesis of 3，4-dihydroxymandelic Acid in an Engineered Escherichia coli Strain

LI Xiao-lin1，2ZHOU Wei2ZHUANG Yi-bin2LU Fu-ping1YIN Hua2
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

3，4-dihydroxymandelic acid，an important pharmaceutical and spices intermediate，possesses strong antioxidative and radical scavenging activities. To achieve the de novo biosynthesis of 3，4-dihydroxymandelic acid in Escherichia coli，the genes of hydroxymandelate synthase（HmaS）from Streptomyces coelicolor and 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase（HpaBC）from E. coli were cloned into pTrcHisB and overexpressed in an engineered E. coli strain MG1655/ΔA. After induction of IPTG and optimization of the inducing temperature，the yield of 3，4-dihydroxymandelic acid reached 240 mg/L in shake flask after 36 hours fermentation，laying a foundation for the large-scale fermentation production of 3，4-dihydroxymandelic acid .

Escherichia coli；3，4-dihydroxymandelic acid；biosynthesis；HmaS；HpaBC

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.015

2016-03-23

国家自然科学基金资助项目（31400026）

李晓林，女，硕士研究生，研究方向：天然产物合成生物学，E-mail：li_xl@tib.cas.cn；周威为本文并列第一作者

殷华，女，博士，研究方向：天然产物合成生物学；E-mail：yin_h@tib.cas.cn