UPLC-Q-TOF MSE技术结合UNIFI数据库筛查方法快速分析巴戟天化学成分

王美玲，张清清，付 爽，刘月红，梁钏镭，陈 娜，丁永胜，王海丽，瞿晓梅，赵保胜，高晓燕

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.北京中医药大学，北京中医药研究院，北京 100029)

UPLC-Q-TOF MSE技术结合UNIFI数据库筛查方法快速分析巴戟天化学成分

王美玲1，张清清1，付 爽1，刘月红1，梁钏镭1，陈 娜1，
丁永胜1，王海丽1，瞿晓梅1，赵保胜2，高晓燕1

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.北京中医药大学，北京中医药研究院，北京 100029)

采用UPLC-Q-TOF MSE技术结合UNIFI数据库筛查方法对巴戟天中的化学成分进行了快速鉴定。对于已知化合物，利用其名称、分子式、结构式等信息补充完善UNIFI数据库，进行数据筛查，依据其精确分子质量、特征离子、中性丢失、MS/MS裂解规律、色谱保留行为等信息，结合对照品信息和文献报道等对其进行验证；对于未知成分，根据其精确分子质量、质谱裂解碎片、色谱保留行为以及已知同类化合物的特征碎片，对其进行结构表征。本实验共鉴定出110个化合物，包括8个寡糖类、12个环烯醚萜类、58个蒽醌类化合物和32个其他类化合物；推断出8个未知化合物，包括1个有机酸、2个苷类化合物、5个环烯醚萜类成分，其中4个是潜在的新化合物，另外4个为巴戟天中首次发现的化合物。该方法可对巴戟天药材中的化学成分进行快速、全面的分析，为巴戟天药材的质量控制和药效物质基础研究奠定基础。

UPLC-Q-TOF MSE；UNIFI数据库；巴戟天；快速鉴定；表征

巴戟天为茜草科(Rubiaceae)植物巴戟天(MorindaofficinalisHow.)的根，是“四大南药”之一，有补肾阳、壮筋骨、祛风湿的功效[1]，也有抗抑郁、抗癌、抗炎镇痛等作用[2]。这些药效作用与巴戟天所含多种类型的化学成分有关。目前针对巴戟天化学成分的研究仍以色谱分离为主，缺乏对其整体的研究。由于中药化学成分复杂多样、含量差异较大，利用传统分离、纯化的方法耗时耗力，且对于新化合物的发现缺乏针对性，这将阻碍其药理作用及机制研究的进展。

近年来，液相色谱-质谱联用技术成为天然药物中活性成分快速分离和鉴定的有力手段[3]。常规的液质联用鉴定化合物的方法是手动提取每个色谱峰，根据色谱峰的准分子离子峰、碎片离子峰以及保留时间等信息，结合对照品及文献数据来推断化合物的结构，该方法耗时且效率较低[4]。

本研究拟基于UPLC-Q-TOF MS技术，结合UNIFI数据库筛查，制订一种天然产物整体解决方案的多成分鉴定策略。该策略共分为3步：1) 建立巴戟天数据库。通过检索Scifinder、Chemspider 等数据库并结合相关文献报道[5-8]，收录151个化合物的信息，包括化合物的名称、分子式和结构式(结构式保存为.mol格式的文件)等；2) 鉴定已知化合物。将采集的Continuum原始数据导入UNIFITM定性分析软件，通过设置适当的采集参数对各主要分子离子峰进行识别、校正，并与已建立的目标数据库自动匹配，所有匹配化合物的结构需结合特征离子、色谱保留时间、精确分子质量、分子碎片峰、对照品信息和相关文献等进行进一步验证，排除假阳性结果；3) 表征未知化合物。依据精确分子质量和元素组成分析，得到可能的分子式，通过高能通道中的特征碎片及色谱保留行为，推断其可能的结构类型，以分子式为检索条件，在Scifinder、Chemspider等在线数据库中搜索可能的化学结构式，将可能的结构信息带入UNIFI软件中进一步验证；对于数据库中未检索到的成分，根据其精确质量数、质谱裂解碎片、保留行为以及已知同类化合物的特征碎片等进行结构推断。本工作应用该策略对巴戟天化学成分进行整体研究，希望为全面表征巴戟天的化学成分提供有力手段。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Synapt G2-SI UPLC-Q-TOF MS色谱-质谱联用仪：美国Waters公司产品，配有Masslynx 4.1质谱工作站；KQ5200DA型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品。

乙腈，甲酸：均为质谱纯，美国Fisher公司产品；实验用水：屈臣氏蒸馏水；5种游离蒽醌，包括大黄素(批号：110765-20010)、大黄酸(批号：110757-200206)、大黄素甲醚(批号：110758-201013)、芦荟大黄素(批号：110756-200110)和大黄酚(批号：110796-201017)：纯度均大于98%，由中国药品生物制品检定所提供；耐斯糖(批号：T03F6C2)：上海源叶生物科技有限公司产品；巴戟天药材：安国市仁德兴药材有限公司产品，经北京中医药大学中药学院杨瑶珺教授鉴定为茜草科植物巴戟天MorindaofficinalisHow.的干燥根。

1.2 样品溶液及对照品溶液的制备

将干燥的巴戟天药材粉碎，精密称取两份2.0 g药材粉末，置于磨口三角瓶中，分别加入20 mL 50%和95%的甲醇水溶液，超声提取1 h，以12 000 r/min离心10 min，取上清液，备用。

精密称取适量的大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酚、耐斯糖对照品，加入甲醇超声溶解，并定容至10 mL，于4 ℃避光保存。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件 寡糖类化合物采用Acquity UPLC BEH Amide色谱柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)分离；流动相：0.1%甲酸水(A)，乙腈(B)；梯度洗脱程序：0～2 min(65%B)，2～6 min(65%～60%B)，6～8 min(60%～55%B)，8～10 min(55%B)；柱温：40 ℃；样品室温度：4 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL。

蒽醌和环烯醚萜类化合物采用Acquity HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)分离，梯度洗脱程序：0～2 min(0.5%B)，2～4 min(0.5%～2%B)，4～6 min(2%～28%B)，6～8 min(28%～40%B)，8～12 min(40%～65%B)，12～16 min(65%～80%B)，16～18 min(80%B)，18～22 min(80%～98%B)，22～24 min(98%B)，24.1 min(0.5%B)；柱温：40 ℃；样品室温度：4 ℃；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL。

1.3.2 质谱条件 采用ESI源负离子模式检测，亮氨酸脑啡肽作为校正液。毛细管电压2.2 kV，锥孔电压40 V，离子源温度100 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，脱溶剂气流速800 L/h，采用MSE扫描模式检测。低能通道碰撞电压6 V，高能通道碰撞电压10～80 V，质量扫描范围m/z100～1 500，采用Continuum模式下的3D数据采集，MassLynx V4.1数据处理工作站以及以中药数据库为基础的UNIFI 1.7软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

由于巴戟天提取物中含有许多同分异构体，尤其是蒽醌类、环烯醚萜类化合物，虽然可以通过提取离子色谱图区分重叠峰，但对于元素组成相同、裂解规律相似的同分异构体，需要足够清晰的色谱分离才能被识别。为全面鉴定和表征巴戟天中的各类成分，本实验对提取溶剂、色谱条件、质谱条件进行了优化。通过比较主峰的峰面积及响应值，确定寡糖类最佳提取溶剂为50%甲醇溶液，而环烯醚萜类、蒽醌类及其他类成分在95%甲醇溶液中提取效率较高。由于每类化合物的极性不同，实验选择了两种色谱柱，最终优化的色谱条件已于1.3.1节中列出。通过比较正、负离子2种扫描模式，发现在负离子模式下质谱响应更强，故实验选择在负离子模式下进行，得到巴戟天甲醇提取化合物的基峰强度(base peak integration, BPI)色谱图示于图1。

2.2 已知化合物的鉴定

利用UNIFITM定性分析软件匹配化合物的结构需通过标准品和文献报道进一步验证，排除假阳性结果。本实验共鉴定出110个化合物，包括8个寡糖类、12个环烯醚萜类、58个蒽醌类化合物，以及32个其他类化合物。

2.2.1 低聚糖的鉴定 寡糖类化合物是巴戟天抗抑郁的主要有效成分，相邻寡糖之间相差一个分子质量为162 u(C6H10O5)的六碳糖。寡糖类成分的极性较强，在C18色谱柱上难以保留，因此选用适合糖类分析的Amide色谱柱。基于UNIFI软件推断的裂解碎片，结合文献中的质谱数据及标准品对照方法，共鉴定了8个寡糖类成分。下面以峰3为例，阐述寡糖类成分的鉴定过程。峰3的准分子离子峰为m/z665.214 7[M-H]-，其高能通道质谱图和裂解碎片示于图2。峰3产生[M-H-(C6H10O5)n]-、[M-H-(C6H10O5)n-H2O]-碎片离子，这与耐斯糖标准品的碎片离子一致，结合文献报道[9-10]，可将该化合物鉴定为耐斯糖，其可能的裂解途径示于图3。

图1 负离子模式下，巴戟天50%醇提物的BPI图(a)和95%醇提物的BPI图(b)Fig.1 BPI chromatogram of 50% methanol extracts (a) and95% methanol extracts (b) of Morinda officinalis How.in negative ion mode

化合物峰1～8的每个相邻峰之间相差162 u，它们具有相同的裂解行为，均产生丢失n(C6H10O5)、n(C6H10O5)-H2O的特征碎片离子。根据裂解碎片的类型、Amide色谱柱上的保留行为，并结合文献报道[10]，对峰1～8进行鉴定，其结果列于附表1(篇幅所限，请登录《质谱学报》官网下载附表1。网址：http:∥www.jcmss.com.cn/CN/volumn/current.shtml)。

2.2.2 环烯醚萜的鉴定 巴戟天中的环烯醚萜类化合物是一类生物活性较强的化合物，其C1位多为羟基，且C1—OH性质活泼，多与葡萄糖结合成苷。本实验共鉴定出12个化合物，以峰15为例阐述其鉴定过程。峰15的准分子离子峰为m/z389.108 9[M-H]-，其高能通道质谱图和裂解碎片示于图4(裂解碎片详细信息列于附表1)。峰15产生m/z227.055 8 [M-H-C6H10O5]-，m/z345.118 7 [M-H-CO2]-碎片离子，结合文献[11]，可推断该化合物为去乙酰车叶草苷酸，其可能的裂解途径示于图5。

图2 负离子模式下，化合物峰3的高能质谱图Fig.2 MS spectra in high energy scan of peak 3 in negative ion mode

图3 负离子模式下，化合物峰3可能的质谱裂解途径Fig.3 Fragmentation pathway of peak 3 in negative ion mode

图4 负离子模式下，化合物峰15的高能质谱图Fig.4 MS spectra in high energy scan of peak 15 in negative ion mode

此外，负离子模式下还存在一系列的环烯醚萜类成分，其分子式分别为C16H22O11(峰13、14、16、17)，C26H30O15(峰19)，C9H12O3(峰22)，C17H26O11(峰24、27)，C18H24O12(峰23、28)和C18H22O11(峰31)。根据裂解碎片类型、含量高低和在反相C18柱上的色谱行为，结合相关文献[6-7,11-12]进行鉴定，其结果列于附表1。

2.2.3 蒽醌类化合物的鉴定 蒽醌类化合物是巴戟天化学成分中研究最早、最多的一类，其结构特点是母核均为蒽醌类单母核，取代基多为甲基、甲氧基、羟甲基、羟基等。本实验共鉴定了58个靶标蒽醌类化合物。

峰47、50、56、71、81具有相同的准分子离子峰m/z285.039 6 [M-H]-，其分子式为C15H8O6，这5个化合物可能互为同分异构体。高能通道存在共有特征碎片m/z285.039 6 [M-H]-和m/z257.045 0 [M-CO-H]-。文献[10]报道，分子式为C15H8O6的化合物有ω-羟基大黄素、1,3,6-三羟基-2-甲氧基蒽醌、1,3,5,6-四羟基-2-甲基蒽醌。峰47、50、71和81的高能通道中存在m/z270.017 1 [M-H-CH3]-、m/z242.021 8 [M-H-CH3-CO]-的碎片信息，表明取代基中有甲基或甲氧基存在，据此可推断为1,3,6-三羟基-2-甲氧基蒽醌或1,3,5,6-四羟基-2-甲基蒽醌。峰56的基峰离子为m/z253.049 8 [M-H-CH2OH]-，没有m/z270.017 1、242.021 8的碎片信息，推断其为ω-羟基大黄素。

图5 去乙酰车叶草苷酸可能的质谱裂解途径Fig.5 Fragmentation pathway of deacetylasperulosidic acid in negative ion mode

此外，负离子模式下还存在一系列蒽醌类成分，其分子式分别为C15H10O4(峰41、55、89、90、95)，C15H10O5(峰42、51、53、67、80、92)，C16H12O5(峰43、61、83、99)，C16H10O6(峰44、65)，C15H8O6(峰46、54、66、70)，C15H8O5(峰48、52、57、69、88)，C15H8O7(峰58、64)，C15H8O4(峰59、84)，C14H8O5(峰49、63、74)，C14H8O3(峰60、68、73)和C15H10O3(峰71、76、79)。根据裂解碎片类型、含量高低和在反相C18柱上的色谱行为，并结合相关文献[7,13-14]进行鉴定，其结果列于附表1。

2.2.4 其他类化合物的结构分析及鉴定 对于一些含量较低、种类较少且规律性不强的化合物，根据已有文献[5-8]，应用提取离子色谱法(extracted ion chromatogram, EIC)及UNIFI软件的自动匹配功能进行提取与鉴定，共推断出32个其他类化合物，包括有机酸类、氨基酸等成分。实验测得的各化合物准分子离子峰的精确质量数均在5×10-6误差范围内，具体质谱数据列于附表1。

2.3 未知化合物的表征

本实验共鉴定出8个未知化合物(峰18、21、25、26、29、30、32、104)，其中4个为潜在的新化合物，另外4个为巴戟天中首次发现的化合物。

峰18的准分子离子峰为m/z405.103 6 [M-H]-，与去乙酰车叶草苷酸相比多了一个O原子，其高能通道质谱图示于图6。高能通道存在m/z225.040 0 [M-H-C6H12O6]-、m/z361.113 6 [M-H5-CO2]-、m/z181.049 9 [M-H-C6H12O6-CO2]-碎片离子(具体裂解碎片信息列于附表1)，与去乙酰车叶草苷酸的裂解规律相似，推断其结构可能在7,8双键处加了一个羟基。在Scifinder、Chemspider 等在线数据库中未检索到与之相匹配的结构，因此推断化合物18为潜在新化合物，暂时将其命名为羟基-去乙酰车叶草苷酸。

峰25和26的准分子离子峰为m/z447.113 6 [M-H]-，根据精确分子质量计算该化合物的分子式为C18H24O13，与车叶草酸相比多了一个O原子。其高能通道存在m/z447.113 6 [M-H]-、m/z387.093 0 [M-H-CH3COOH]-、m/z179.054 9 [M-H-C12H14O7]-、m/z113.023 4 [M-H-C13H23O10]-碎片离子，推断其结构为7,8位双键处加了一个羟基，暂时将其命名为7-羟基车叶草酸或其同分异构体。

峰29的准分子离子峰为m/z443.191 0[M-H]-，根据精确分子质量计算该化合物的分子式为C21H32O10。其高能通道存在m/z183.102 1[M-H-C11H17O7]-碎片离子和m/z179.054 8、161.044 8等环烯醚萜苷特征离子，推断峰29为环烯醚萜苷类化合物。在Chemspider在线数据库中检索得到化合物Methyl(1S,4aS,5R,7aS)-5-butoxy-1-(β-D-glucopyranosyloxy)-7-methyl-1,4a,5,7a-tetrahydrocyclopenta[c]pyran-4-carboxylate(CSID： 28509365)，其结构与实验测得的多级质谱碎片相符，据此推断该化合物为CSID：28509365或其同分异构体，这是在巴戟天植物中首次发现的化合物。同理，峰30的分子式为C16H28O9，存在m/z183.102 3[M-H-C6H12O6]-、m/z201.113 2 [M-H-C6H10O5]-特征碎片及m/z179.054 8、161.044 8糖苷碎片，经Chemspider在线数据库检索，化合物(1S,4R,4aS,6S,7S,7aR)-4,6-Dihydroxy-4,7-dimethyloctahydrocyclopenta[c]pyran-1-yl-β-D-glucopyranoside(CSID：28286650)的结构与以上质谱信息相符，据此可推断峰30为CSID：28286650化合物或其异构体。峰32的分子式为C17H30O9，根据其高能通道存在m/z179.054 8、161.044 8糖苷碎片的信息及其色谱保留行为，推断该化合物可能为苷类化合物。在Scifinder、Chemspider等在线数据库中未检索到与之相匹配的结构，因此该化合物可能为潜在新化合物。

图6 负离子模式下，化合物峰18的高能质谱图Fig.6 MS spectra in high energy scan of peak 18 in negative ion mode

峰21的准分子离子峰为m/z373.112 7[M-H]-，根据精确分子质量计算该化合物的分子式为C16H22O10，与去乙酰车叶草苷酸相比少一个O原子，其高能通道存在m/z211.060 0 [M-H-C6H10O5]-、m/z193.050 3 [M-H-C6H12O6]-、m/z149.059 6[M-H-C6H12O6-CO2]-等环烯醚萜特征离子，因此推断峰21为环烯醚萜类化合物。在Scifinder、Chemspider等在线数据库中搜索其可能的化学结构式，代入UNIFI软件中进一步筛查，最终发现其与geniposidic acid的结构相匹配，因此推断该化合物为geniposidic acid或其同分异构体，这也是在巴戟天植物中首次发现的化合物。峰104存在m/z373.112 7 [M-H]-、m/z225.222 2 [M-H-CH2O2]-等碎片离子，与2-羟基棕榈酸的结构匹配，推断其为2-羟基棕榈酸或其同分异构体。

3 讨论

本研究发现，UPLC-Q-TOF MSE技术结合UNIFI天然产物解决方案可提高化合物筛查和鉴定的效率，但UNIFI给出的理论断裂位点与实际裂解行为存在差异。以峰3为例，根据UNIFI提供的断裂位点无法得到m/z485.149 8[M-H-C6H12O6]-碎片离子，而推断碎片是在丢失葡萄糖残基的基础上脱水形成的m/z485.149 8 [M-H-C6H10O5-H2O]-，并且得到文献的支持[9]。根据总结的各类化合物的特征碎片及色谱保留行为，推断其可能的结构类型，再将Scifinder、Chemspider等在线数据库中搜索的可能的结构信息代入UNIFI软件中进一步验证，进行未知化合物的鉴定，这将为未知化合物的鉴定提供思路。巴戟天中蒽醌类和环烯醚萜类化合物中同分异构体较多，且多为取代基位置异构体，目前，利用UPLC-Q-TOF MSE技术尚不能区分取代基位置异构体，需进一步通过NMR进行确定。

4 结论

本实验建立了一种基于UPLC-Q-TOF MSE技术对巴戟天药材中的化学成分进行快速和较全面的分析方法。根据化合物的精确分子质量、色谱保留行为，总结出各类化合物的质谱裂解规律，结合文献报道，同时借助UNIFI软件平台，共鉴定出110个化合物，包括8个寡糖类、12个环烯醚萜类、58个蒽醌类化合物和32个其他类化合物；鉴定出8个未知化合物，包括1个有机酸、2个苷类化合物、5个环烯醚萜类成分。该方法可快速、有效地对中药(复方)组分或其不同极性部位的成分进行特征图谱表征和结构分析，可为中药化学成分的深入研究提供方法参考。

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Characterization ofMorindaofficinalisHow. by UPLC-Q-TOF MSECoupled with UNIFI Database Filter

WANG Mei-ling1, ZHANG Qing-qing1, FU Shuang1, LIU Yue-hong1, LIANG Chuan-lei1, CHEN Na1, DING Yong-sheng1, WANG Hai-li1, QU Xiao-mei1, ZHAO Bao-sheng2, GAO Xiao-yan1

(1.SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,china;2.AcademyofTraditionalChineseMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,china)

Liquid chromatography coupled with high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) was widely used for the identification of components from traditional Chinese medicine (TCM), but the characterization of the unknown compounds was still a great challenge currently. Therefore, there is an urgent need to establish a strategy for rapid and comprehensive identification of chemical ingredients in TCMs. In this study, a multiple ingredients identification strategy was proposed based on the UPLC-Q-TOF MSEcoupled with the UNIFI informatics platform. This method includes three steps: the first step was to set up an in-house library based on the literature to complement the UNIFI database. The second step was to screen and verify the known ingredients from raw data. The peaks were screened preliminarily by UNIFITMplatform based on the in-house database. For the known compounds, based on the accurate mass, fragment ions, neutral losses, retention behaviors, reference standards, previous reports, the compounds were validated furtherly. The last step was to identify or characterize the chemical structures of the potential novel components with similar MS fragmentation pattern of the identified ingredients. The possible molecular formula was obtained by the accurate mass. The candidate compounds were obtained by the online database possible structure was verified by “Fragment match” function and characteristic fragments. This strategy was successfully applied to identify and deduct components ofMorindaofficinalisHow.. A total of 110 chemical components are identified fromMorindaofficinalisHow., including 8 oligosaccharides, 12 iridoids, 58 anthraquinones and 32 other compounds. 8 components are tentatively characterized, including 5 iridoids, 2 glycosides compounds and 1 organic acid. Four of them are potential new compounds, the other components are found inMorindaofficinalisHow. for the first time. This study provides an efficient data processing strategy to rapidly profile the chemical constituents of complicated herbal extracts.

UPLC/Q-TOF MSE; UNIFI database; MorindaofficinalisHow.; quick identification; characterization

2016-07-11;

2016-11-17

教育部大学生创新性实验计划项目(201610026050)资助

王美玲(1990—)，女(汉族)，山东东营人，硕士研究生，中药分析学专业。E-mail: wangmeiling@bucm.edu.cn

赵保胜(1973—)，男(汉族)，河北衡水人，副研究员，从事中药药效与物质基础研究。E-mail: zhaobs1973@163.com

高晓燕(1967—)，女(满族)，河北承德人，研究员，从事中药分析学研究。E-mail: gaoxiaoyan0913@sina.com

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0075-08

10.7538/zpxb.2017.38.01.0075