酶解法制备菜籽多肽的工艺研究

杨 雪，李云亮，王禹程，黄姗芬，马海乐

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

酶解法制备菜籽多肽的工艺研究

杨 雪，李云亮，王禹程，黄姗芬，马海乐*

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

本文以菜籽粕为原料，酸处理将菜籽粕脱毒后，采用碱溶酸沉法提纯菜籽蛋白，再用碱性蛋白酶酶解菜籽蛋白制备菜籽多肽，采用单因素逐级优化试验设计，以酶解液中菜籽多肽的含量为指标优化酶解工艺参数。结果表明：酸处理后的硫甙含量下降了84.32%，碱溶酸沉后，蛋白的提取率为76.25%。单因素逐级优化试验的结果表明：碱性蛋白酶酶解的最适条件为底物浓度4%、加酶量7%（E/S）、温度50℃、pH 8.5、酶解时间120 min，该条件下多肽含量为（35.4±0.11）mg/mL。

菜籽蛋白；脱毒；多肽；碱性蛋白酶

菜籽粕是菜籽榨油后的副产物，其菜籽蛋白含量约为30%，营养价值与大豆蛋白接近（Fleddermanna等，2013），具有很高的开发利用价值（付敏等，2013），但是由于菜籽粕中含有一些有毒物质，主要为硫甙及其代谢衍生物，只能在饲料中少量添加，因此对菜籽蛋白的合理加工是充分利用其优质蛋白质的有效途径。

菜籽粕中的毒性物质可通过一定的方法脱除，脱毒后的菜籽蛋白可大量用于饲料或者食品中。常见的脱毒方法包括物理、化学和生物脱毒法，其中化学脱毒方法脱毒较彻底。研究表明，采用硫酸溶液脱毒后菜籽粕中硫甙衍生物的脱除率均高于90%，且不影响蛋白质和氨基酸的种类（兰文菊等，2012）。采用酸浸溶法脱毒后的菜籽粕，再经过碱溶酸沉方法提取后可获得优质的脱毒菜籽蛋白。制备具有多种生物学活性的多肽是有效利用脱毒菜籽蛋白的途径之一。

多肽具有多种生物学活性，研究发现，菜籽多肽具有降血压（Mäkinen等，2016）、抗氧化（秦晓佩等，2016；张晶等，2016）、抗凝血 （王子伟，2012）、抗肿瘤和增强免疫力（薛照辉等，2007）等功能。制备菜籽多肽的方法主要包括酶解法和发酵法，发酵法的耗时较长，因此，本文对酶解法制备菜籽多肽的工艺进行了研究，为菜籽多肽作为保健食品开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 菜籽粕，江苏天琦生物科技有限公司，蛋白质含量为31.2%；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器及设备 TLL-C台式冷冻离心机，军事医学科学院试验仪器厂；PHS-3C精密pH计，上海精密科学仪器有限公司；CARY100紫外扫描分光光度计，美国瓦里安公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菜籽粕的脱毒及蛋白质提取 菜籽蛋白的脱毒参考兰文菊等（2012）的方法略有修改。准确称取菜籽粕100 g，加入浓度为4%的硫酸2 L，于60℃下搅拌、浸提90 min，结束后过滤，滤渣冻干后取部分样品测定硫甙含量，并与未处理前的菜籽粕进行对比，其余部分用于蛋白质提取。

蛋白质的提取采用碱溶酸沉方法 （高瑀珑，2014），称取25 g上述冻干样品，加入0.2%氢氧化钠溶液400 mL，碱提60 min后，于5000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，用3 mol/LHCl调节pH为4，沉淀60 min后，于5000 r/min条件下离心10 min，水洗2次，收集沉淀。将沉淀冷冻干燥后，研磨过筛，即得到提纯后的菜籽蛋白，4℃冷藏待用。

1.3.2 脱毒率及蛋白质提取率 硫甙含量的测定采用氯化钯法（魏晓飞等，2009），蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法。脱毒率及蛋白质提取率的计算公式如下：

1.3.3 酶解工艺参数的确定 采用单因素逐级优化试验设计，以酶解液中多肽的含量为指标筛选工艺参数。具体操作步骤如下：称取12 g菜籽蛋白，加入蒸馏水配成相应底物浓度的溶液，调节pH，控制温度，加入碱性蛋白酶酶解，酶解过程中不断加入1 mol/L氢氧化钠调节pH恒定，酶解结束后于沸水浴下灭酶10 min，5000 r/min离心10 min，收集上清液，测定上清液中多肽的含量。酶解各因素和水平的设定见表1。

表1 酶解各因素水平

1.3.4 菜籽多肽的含量测定 菜籽多肽的含量测定采用双缩脲法（杜冬梅，2012）。取5 mL酶解液加入5 mL 10%三氯乙酸水溶液，混合均匀后静置10 min，5000 r/min离心10 min，取1 mL上述溶液加蒸馏水稀释10倍，取稀释后的溶液6 mL，加入双缩脲试剂4 mL，混合后静置10 min，于540 nm波长下测定其OD值。同时以酪蛋白为标准物制作标准曲线，利用标准曲线求得样品中多肽的质量浓度。

1.4 数据分析 采用SPSS 16.0软件单因素方差分析各因素、水平之间的显著性。

2 结果与分析

2.1 菜籽粕的脱毒率及蛋白质提取率 以处理前后硫甙的含量来衡量菜籽粕的脱毒率，以菜籽粕提取前和提取后蛋白质量的比值作为蛋白质的提取率，具体数据见表2、3。

表2 菜籽粕脱毒率

表3 菜籽蛋白提取率

2.2 酶解参数对酶解产物中多肽含量的影响

2.2.1 底物浓度对酶解产物中多肽含量的影响由图1可知，酶解产物中多肽的含量随底物浓度的升高呈现先升高后降低的趋势，在底物浓度为3%时多肽的含量最高，3%和4%的底物浓度酶解产物中的多肽含量无显著差异（P＞0.05），原因可能是因为底物浓度为2%时，因加水量过多，导致酶和底物碰撞的几率降低，当底物浓度增加到3%时酶与底物的碰撞几率达到最大值，当底物浓度再次增大时，因浓度过高，产生了产物抑制，因此会出现先升高后降低的趋势。

4%底物浓度可大量减少酶解过程中水的用量，且与3%底物浓度的结果之间无显著差异，因此选用底物浓度为4%做后续的单因素试验。

图1 底物浓度对酶解产物中多肽含量的影响

2.2.2 加酶量对酶解产物中多肽含量的影响 由图2可知，酶解产物中多肽的含量随加酶量的升高呈现升高的趋势，在加酶量为7%（E/S）时，酶解液中多肽的含量趋于平缓，且7%与8%加酶量的酶解产物中多肽含量无显著差异（P＞0.05），说明当加酶量为7%时，酶相对于底物来说处于过量状态，因此，为了降低成本选用加酶量为7%（E/S）。

图2 加酶量对酶解产物中多肽含量的影响

2.2.3 温度对酶解产物中多肽含量的影响 由图3可知，多肽含量在酶解温度50℃时最高，且与55℃的结果之间无显著差异（P＞0.05），因此，选择酶解温度为50℃进行后续单因素试验。

图3 温度对酶解产物中多肽含量的影响

2.2.4 pH对酶解产物中多肽含量的影响 由图4可知，pH对酶解特性的影响与温度类似。呈现先上升后下降的趋势。在pH 8.5时，其酶解产物中多肽含量最高，因此，选用pH 8.5做后续试验。

图4 pH对酶解产物中多肽含量的影响

2.2.5 酶解时间对酶解产物中多肽含量的影响由图5可知，酶解液中的多肽含量呈现先上升后下降的趋势，并且在120 min时达到最大值。原因是酶解时间过长，导致蛋白质过度降解，生成大量的氨基酸，使酶解物中多肽的含量降低。因此设定酶解时间为120 min。

图5 酶解时间对酶解产物中多肽含量的影响

3 结论与讨论

本文对菜籽粕的脱毒、菜籽蛋白质的提取以及菜籽多肽的制备工艺进行了研究，结果表明：（1）采用酸处理脱毒，硫甙的脱毒率为84.32%；（2）碱溶酸沉法提取的菜籽蛋白质，其提取率为76.25%；（3）制备菜籽多肽的最佳酶解工艺为：底物浓度4%、加酶量7%（E/S）、温度50℃、pH 8.5、酶解时间120 min，在此条件下酶解后上清液中的多肽含量为（35.4±0.11）mg/mL。

[1]杜东梅.酶法制备菜籽多肽及其特性研究：[硕士学位论文][D].长沙，湖南农业大学，2012.

[2]付敏，何军，余冰，等.混菌固态发酵对菜籽饼营养价值及抗营养因子含量的影响[J].动物营养学报，2013，25（7）：1579～1586.

[3]高瑀珑，郑锐，王玉梅，等.菜籽分离蛋白分子质量分布及酶解条件的研究[J].中国粮油学报，2014，29（6）：38～45.

[4]兰文菊，彭密军，彭胜，等.酸溶液对菜籽粕脱毒工艺探讨[J].中国粮油学报，2012，27（11）：67～71.

[5]刘敏佳.菜子粕的抗营养因子及其脱毒研究进展 [J].湖北畜牧兽医，2016，37（3）：9～12.

[6]秦晓佩，余筱洁，杨华，等.菜籽饼粕蛋白模拟胃肠消化过程抗氧化研究[J].中国粮油学报，2016，3（1）：21～26.

[7]王子伟.菜籽肽的酶法制备及其抗凝血活性研究：[硕士学位论文][D].郑州，河南工业大学，2012，39～54.

[8]魏晓飞，王在贵，杨世高.影响氯化钯法测定油菜籽中硫甙含量的因素研究[J].饲料工业，2009，30（17）：42～44.

[9]薛照辉，尉万聪，吴谋成，等.菜籽肽抑制肿瘤作用和对免疫功能的影响[J].中国粮油学报，2007，22（1）：73～75.

[10]张晶，张怡一，徐斐然，等.菜籽多肽体外和细胞内抗氧化性评价及氨基酸分析[J].食品科学，2016，37（13）：36～41.

[11]Fleddermanna M，Fechnera A，Röβler A，et al.Nutritional evaluation of rapeseed protein compared to soy protein for quality，plasma amino acids，and nitrogen balance-Arandomized cross-over intervention study in humans[J]. Clinical Nutrition，2013，32（4）：519～526.

[12]Mäkinen S，Streng T，Larsen L B，et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory and antihypertensive properties of potato and rapeseed protein-derived peptides[J].Journal of Functional Foods，2016，25：160～173.■

In this paper，rapeseed meal as raw material was treated by acid to detoxification.Detoxified rapeseed meal was dissolved by alkaliand participated by acid to prepare rapeseed protein，which was en扎ymoly扎ed by alkaline protease for preparation peptides.Single-factor stepwise optimi扎ation experimental design was used，content as an index to optimi扎e en扎ymatic process parameters.The results showed that glucosinolate content after acid treatment decreased by 84.32%，after the alkali-extration and acid-precipitation，protein extraction rate was 76.25%.Single factor optimi扎ation test results showed that：the optimal conditions for alcalase were substrate concentration of 4%，en扎yme dosage of 7%（E/S），temperature of 50℃，pH 8.5，hydrolysis time 120 min，peptide content reached（35.4±0.11）%under this condition.

rapeseed protein；detoxification；peptide；alcalase

S816.7

A

1004-3314（2017）02-0019-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170205

国家863计划“高生物利用度蛋白制备关键技术研究与开发”（2013AA102203）；江苏大学高级人才科研启动基金（16JDG049）

*通讯作者