白介素1受体相关激酶1在乳腺癌紫杉醇耐受患者治疗中的作用机制研究

施华球，谢瑞莲

·论著·

白介素1受体相关激酶1在乳腺癌紫杉醇耐受患者治疗中的作用机制研究

施华球*，谢瑞莲

目的 探讨白介素1受体相关激酶1(IRAK1)在乳腺癌紫杉醇耐受患者治疗中的作用机制。方法 选取2013年5月—2015年9月赣南医学院第一附属医院肿瘤科收集的乳腺组织(对照)及乳腺癌组织，其中对照女性16例，Basal-like型乳腺癌患者38例，Luminal-A型乳腺癌患者25例，Luminal-B型乳腺癌患者31例，HER2过表达型乳腺癌患者31例，三阴乳腺癌患者58例。取对照乳腺组织及乳腺癌组织，采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测IRAK1 mRNA的相对表达水平，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测炎性因子白介素(IL)-6、IL-8和CXC趋化因子配体1(CXCL-1)表达水平。培养乳腺癌细胞株HMEC、MCF7、MB415、MB436、MB468、BT549、SUM159，采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导乳腺癌细胞株产生紫杉醇耐受性，检测未经处理的细胞株和紫杉醇耐受细胞株IRAK1 mRNA相对表达水平。经shRNA或空白序列NC-shRNA转染紫杉醇耐受乳腺癌细胞株，采用qPCR检测增殖相关基因细胞周期蛋白(Cyclin)D1、增殖细胞核抗原(PCNA)和Cyclin A相对表达水平，凋亡相关基因p53、c-myc、Bcl-2、c-erb-2相对表达水平，迁移相关基因Cullin 1、Bcl-6和KLF6相对表达水平，采用ALDEFLUOR实验检测醛脱氢酶(ALDH)活性。结果 各类型乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1 mRNA相对表达水平均高于不耐受患者(P<0.05),三阴乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1 mRNA相对表达水平均高于其他类型乳腺癌紫杉醇耐受患者(P<0.05)。对照者及各类型乳腺癌紫杉醇耐受患者IL-6、IL-8、CXCL-1表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株IRAK1 mRNA相对表达水平均高于未经紫杉醇处理的细胞株(P<0.05)。经shRNA转染的紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株Cyclin D1、PCNA、Cyclin A相对表达水平均低于经NC-shRNA转染的各乳腺癌细胞株,p53、c-myc、Bcl-2、c-erb-2相对表达水平均高于经NC-shRNA转染的各乳腺癌细胞株，Cullin 1、Bcl-6相对表达水平、ALDH活性均低于经NC-shRNA转染的各乳腺癌细胞株，KLF6相对表达水平高于经NC-shRNA转染的各乳腺癌细胞株(P<0.05)。结论 IRAK1在紫杉醇耐受的乳腺癌细胞，尤其是三阴乳腺癌细胞中发挥重要作用。抑制IRAK1表达可显著降低乳腺癌细胞的增殖和迁移能力，诱导癌细胞凋亡，IRAK1抑制剂可用于乳腺癌尤其是三阴乳腺癌的治疗。

乳腺肿瘤；抗药性，肿瘤；白介素1受体相关激酶类；细胞增殖；细胞凋亡

施华球，谢瑞莲.白介素1受体相关激酶1在乳腺癌紫杉醇耐受患者治疗中的作用机制研究[J].中国全科医学，2017，20(2)：165-171.[www.chinagp.net]

SHI H Q,XIE R L.Mechanisms of interleukin-1 receptor-associated kinase 1 in the treatment for breast cancer patients with resistance to paclitaxel[J].Chinese General Practice，2017，20(2)：165-171.

紫杉醇是乳腺癌患者最常用的化疗药物之一，乳腺癌紫杉醇耐受是临床治疗的最大难题之一[1]。乳腺癌主要包括Basal-like型、Luminal-A型、Luminal-B型、HER2过表达型和三阴乳腺癌，其中三阴乳腺癌最易产生耐受性，发病率和病死率居高不下。因此，研究乳腺癌尤其是三阴乳腺癌紫杉醇耐受的机制，并寻找新型的治疗策略势在必行[2]。白介素1受体相关激酶(IRAK)1在多种癌症的固有免疫反应中发挥重要作用，是IRAK家族中关键的固有免疫信号调节分子。目前，已发现IRAK1有4种剪接异构体，即IRAK1a、IRAK1b、IRAK1s和IRAK1c，其在结构和功能上有共同点，但又各自具有特点。IRAK1c是新发现的剪接异构体，缺少激酶活性，成为当前研究重点。IRAK1具有激酶活性，作为细胞溶质激酶、核激酶及接头蛋白，参与调控Toll样受体(TLR)/白介素1受体(IL-1R)两个受体家族的信号级联反应，调节肿瘤坏死因子α(TNF-α)、Ⅰ型干扰素(IFN)及AP-1等炎性因子的表达[3]，但其在乳腺癌尤其是三阴乳腺癌紫杉醇耐受治疗中的作用机制尚有待进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 乳腺癌细胞株HMEC、MCF7、MB415、MB436、MB468、BT549、SUM159购于ATCC公司；小牛血清和DMEM培养基购于Invitrogen公司；IRAK1的NC-shRNA和shRNA由Dharmacon公司合成；转染试剂Lipofactamin 2000购于Bio-Rad公司；紫杉醇购于江苏恒瑞医药股份有限公司，用所随溶媒1 ml溶解成药物原液，再用DMEM培养基稀释成实验所需浓度；ALDEFLUOR试剂盒购于Stem Cell Technology公司；流式细胞仪购于BD公司。

1.2 乳腺癌组织

1.2.1 组织来源 选取2013年5月—2015年9月赣南医学院第一附属医院肿瘤科收集的女性乳腺活检组织(对照)及乳腺癌患者手术切除的癌组织，其中对照女性16例(因乳腺包块行组织活检，病理证实为乳腺纤维瘤)，平均年龄(45.0±2.3)岁；Basal-like型乳腺癌患者38例，平均年龄(55.0±3.3)岁，紫杉醇耐受18例；Luminal-A型乳腺癌患者25例，平均年龄(52.0±2.6)岁，紫杉醇耐受10例；Luminal-B型乳腺癌患者31例，平均年龄(57.0±1.6)岁，紫杉醇耐受12例；HER2过表达型乳腺癌患者31例，平均年龄(58.0±3.1)岁，紫杉醇耐受10例；三阴乳腺癌患者58例，平均年龄(53.0±2.1)岁，紫杉醇耐受45例。受试者均签署书面知情同意书，本研究经本院伦理学会支持。

1.2.2 IRAK1 mRNA相对表达水平检测 取乳腺癌组织，采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测IRAK1 mRNA的相对表达水平。IRAK1引物序列：上游：5′-GCACCCACAACTTCTCGGAG-3′，下游：5′-CACCGTGTTCCTCATCACCG-3′。PCR反应条件：50 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，重复40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

1.2.3 炎性因子表达水平检测 取对照乳腺组织及紫杉醇耐受患者乳腺癌组织，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测炎性因子白介素(IL)-6、IL-8和CXC趋化因子配体1(CXCL-1)表达水平。(1)包被：设置空白对照和阴性对照，将抗原用稀释液稀释到适当浓度，每孔加入100 μl抗原，为避免蒸发，盖上盖子，37 ℃放置4 h，移除每孔中的液体；(2)封闭酶标反应孔：每孔加满5%小牛血清，37 ℃封闭40 min，去除每孔中的气泡，封闭结束后，用洗涤液满孔洗涤3次，3 min/次；(3)加入待检测样品：将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每个样品设置2个复孔，100 μl/孔，37 ℃孵育1 h，用洗涤液满孔洗涤3次，3 min/次；(4)加入酶标抗体：将酶标抗体按照说明书的要求稀释成特定浓度，37 ℃孵育1 h，用洗涤液满孔洗涤3次，3 min/次；(5)加入底物：加入TMB-过氧化氢尿素溶液，100 μl/孔，37 ℃避光孵育5 min；(6)终止反应：每孔加入终止液50 μl显色，20 min内测定实验结果；(7)结果判断：TMB显色后，在450 nm波长处检测吸光度值，检测时，将空白孔系统调零，用测定标本孔的吸光度值与阴性标本孔平均值的比值表示IL-6、IL-8和CXCL-1表达水平。

1.3 乳腺癌细胞株

1.3.1 细胞培养 乳腺癌细胞株HMEC、MCF7、MB415、MB436、MB468、BT549、SUM159用含有10%小牛血清、100×103U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基培养，培养条件为37 ℃，5%CO2，用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化传代。

1.3.2 紫杉醇耐受乳腺癌细胞株的筛选及IRAK1 mRNA相对表达水平检测 采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击法诱导乳腺癌细胞株产生紫杉醇耐受性，紫杉醇起始浓度为1 nmol/L，终浓度为10 nmol/L，每隔1个月使用5 nmol/L紫杉醇间断冲击，诱导12个月后得到紫杉醇耐受的乳腺癌细胞株。诱导过程中，培养液含有大量被紫杉醇杀死的细胞，移除培养液并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，剩下的细胞即为紫杉醇耐受的乳腺癌细胞株。MTT法测定紫杉醇对亲本细胞和耐受细胞的半数致死浓度(IC50)，耐受指数(RI)=耐受细胞株IC50/亲本细胞株IC50，本实验乳腺癌细胞株耐受指数见表1。检测未经紫杉醇处理的细胞株和紫杉醇耐受细胞株IRAK1 mRNA相对表达水平。实验重复3次。

1.3.3 shRNA转染 取对数生长期的紫杉醇耐受乳腺癌细胞株接种于6孔板中，细胞密度为2×105个，培养箱中培养过夜，待细胞密度达到70%～80%时进行shRNA转染或对照序列NC-shRNA转染。用预热过的无血清DMEM培养基洗涤待转染的细胞，用DMEM将2.5 μl NC-shRNA或shRNA和5 μl Lipofactamin 2000分别稀释至250 μl，混匀后室温放置5 min，将二者混匀，室温静置20 min，缓慢加入对应的6孔板中，培养箱中培养24 h后更换预热的DMEM培养基。

表1 乳腺癌细胞株耐受指数

注：IC50=半数致死浓度，RI=耐受指数

1.3.4 细胞增殖相关基因表达水平检测 采用qPCR检测经转染的紫杉醇耐受的乳腺癌细胞株增殖相关基因细胞周期蛋白(Cyclin)D1、增殖细胞核抗原(PCNA)和Cyclin A相对表达水平。提取细胞总RNA，并反转录合成cDNA第一链。Cyclin D1引物序列：上游：5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，下游：5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′；PCNA引物序列：上游：5′-CCTGCTGGGATATTAGCTCCA-3′，下游：5′-CAGCGGTAGGTGTCGAAGC-3′；Cyclin A引物序列：上游：5′-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3′；下游：5′-AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC-3′。PCR反应条件：50 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，重复40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达水平。实验重复3次。

1.3.5 细胞凋亡相关基因表达水平检测 采用qPCR检测经转染的紫杉醇耐受的乳腺癌细胞株凋亡相关基因p53、c-myc、Bcl-2、c-erb-2相对表达水平。p53引物序列：上游：5′-CAGCACATGACGGAGGTTGT-3′，下游：5′-TCATCCAAATACTCCACACGC-3′；c-myc引物序列：上游：5′-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA -3′，下游：5′-CTGCGTAGTTGTGCTGATGT-3′；Bcl-2引物序列：上游：5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG -3′，下游：5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′；c-erb-2引物序列：上游：5′-CAGAAGAAGCGGGTCAAGTTG-3′，下游：5′-GCTCCTCTTTCGGAGTTCAATC-3′。PCR反应条件及计算方法同上。实验重复3次。

1.3.6 迁移能力

1.3.6.1 细胞迁移相关基因表达水平检测 采用qPCR检测经转染的紫杉醇耐受的乳腺癌细胞株迁移相关基因Cullin 1、Bcl-6和KLF6相对表达水平。Cullin 1引物序列：上游：5′-ACACATCTCGGCTCAATTTGC -3′，下游：5′-AGTGTCCACAACATGCTCCAT-3′；Bcl-6引物序列：上游：5′-GGAGTCGAGACATCTTGACTGA -3′，下游：5′-ATGAGGACCGTTTTATGGGCT-3′；KLF6引物序列：上游：5′-GGCAACAGACCTGCCTAGAG -3′，下游：5′-CTCCCGAGCCAGAATGATTTT-3′。 PCR反应条件及计算方法同上。实验重复3次。

1.3.6.2 ALDEFLUOR实验 取106个紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株用ALDEFLUOR缓冲液重悬，添加15 μmol/L醛脱氢酶(ALDH)特异性抑制剂4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和0.15 μmol/L ALDH底物，37 ℃孵育25 min，流式细胞仪检测ALDH活性。实验重复3次。

2 结果

2.1 乳腺癌患者IRAK1mRNA相对表达水平比较 各类型乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1mRNA相对表达水平均高于非耐受患者，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。各类型乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1mRNA相对表达水平比较，差异有统计学意义(F=18.215,P<0.05)，其中三阴乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1mRNA相对表达水平均高于其他类型乳腺癌紫杉醇耐受患者，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 对照与各类型乳腺癌紫杉醇耐受组织炎性因子表达水平比较 对照及各类型乳腺癌紫杉醇耐受组织IL-6、IL-8、CXCL-1表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)； 其中，Basal-like型、Luminal-A型、Luminal-B型、HER2过表达型和三阴乳腺癌紫杉醇耐受组织IL-6、IL-8和CXCL-1的表达水平均高于对照组织，差异有统计学意义(P<0.05,见表3)。

2.3 各乳腺癌细胞株IRAK1mRNA相对表达水平比较 紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株IRAK1mRNA相对表达水平均高于未经紫杉醇处理的细胞株，差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。

2.4shRNA转染对紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株细胞增殖相关基因表达水平的影响 经shRNA转染的紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株CyclinD1、PCNA、CyclinA相对表达水平均低于NC-shRNA转染的各乳腺癌细胞株，差异有统计学意义(P<0.05，见表5)。

Table 2 Comparison of relative expression level of IRAK1 mRNA between various breast cancer with or without paclitaxel-resistance

乳腺癌类型紫杉醇耐受例数IRAK1mRNA相对表达水平t值P值Basal⁃like型10773<0001否20132±016是18189±011Luminal⁃A型4689<0001否15124±026是10165±009Luminal⁃B型4425<0001否19135±014是12173±018HER2过表达型7726<0001否21126±023是10186±016三阴乳腺癌19179<0001否13122±011是45213±014

注：IRAK1=白介素1受体相关激酶1

Table 3 Comparison of relative expression levels of inflammatory cytokines in control breast tissues and paclitaxel-resistant breast cancer tissues

组织例数IL⁃6IL⁃8CXCL⁃1对照16213±012313±021291±016Basal⁃like型18312±011a424±018a328±017aLuminal⁃A型10323±012a439±025a347±021aLuminal⁃B型12319±023a427±017a358±019aHER2过表达型10341±016a453±016a423±018a三阴乳腺癌45561±015a893±021a1256±019aF值420153621647319P值<0001<0001<0001

注：IL=白介素，CXCL-1=CXC趋化因子配体1；与对照组织比较，aP<0.05

2.5 shRNA转染对紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株细胞凋亡相关基因表达水平的影响 经shRNA转染的紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株p53、c-myc、Bcl-2、c-erb-2相对表达水平均高于NC-shRNA转染的各乳腺癌细胞株，差异有统计学意义(P<0.05，见表6)。

2.6 shRNA转染对紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株细胞迁移能力的影响 经shRNA转染的紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株Cullin 1、Bcl-6相对表达水平、ALDH活性均低于NC-shRNA转染的各乳腺癌细胞株，KLF6相对表达水平高于NC-shRNA转染的各乳腺癌细胞株，差异均有统计学意义(P<0.05，见表7)。

Table4ComparisonofrelativeexpressionlevelofIRAK1mRNAinbreastcancercelllineswithresistancetopaclitaxelandthosewithoutpaclitaxeltreatment

干预HMECMCF7MB415MB436MB468BT549SUM159未经紫杉醇处理113±018132±016135±010143±011126±016123±013154±017紫杉醇耐受159±011189±021172±011185±013176±011198±015273±021t值3494508543114272420176289091P值0025000700120013001400020001

Table5Comparisonoftheexpressionlevelsofproliferation-associatedgenesbetweenvariouspaclitaxel-resistantbreastcancercelllineswithNC-shRNAtransfectionandthosewithshRNAtransfection

乳腺癌细胞株CyclinD1NC⁃shRNA shRNA t值 P值PCNANC⁃shRNA shRNA t值 P值CyclinANC⁃shRNA shRNA t值 P值HMEC231±012109±0118737<0001251±013129±0018556<0001138±012108±01329370042MCF7356±018113±00819952<0001258±012103±01822295<0001259±013108±01214226<0001MB415349±021098±01419346<0001289±011078±02417325<0001269±016078±01116541<0001MB436431±023089±02122000<0001337±013083±01116118<0001335±021086±01518192<0001MB468369±016099±01717714<0001265±026089±01310798<0001265±013087±02115532<0001BT549412±014059±01227763<0001372±019069±02222798<0001317±012064±01718118<0001SUM159356±015079±02124976<0001266±021089±01110080<0001258±018098±01911193<0001

注：Cyclin=细胞周期蛋白，PCNA=增殖细胞核抗原

Table6Comparisonoftheexpressionlevelsofapoptosis-relatedgenesbetweenvariouspaclitaxel-resistantbreastcancercelllineswithNC-shRNAtransfectionandthosewithshRNAtransfection

乳腺癌细胞株p53NC⁃shRNA shRNA t值 P值c⁃mycNC⁃shRNA shRNA t值 P值Bcl⁃2NC⁃shRNA shRNA t值 P值c⁃erb⁃2NC⁃shRNA shRNA t值 P值HMEC105±012324±01116879<0001113±015264±0149925<0001115±017427±01420001<0001125±016298±01312063<0001MCF7121±013289±01417087<0001159±017367±01516359<0001152±021356±02314000<0001119±015374±02422251<0001MB415115±021315±01513725<0001108±011295±01417413<0001108±011255±0129987<0001105±011275±01311153<0001MB436109±015376±01221800<0001116±014356±01620996<0001119±014277±01514842<0001119±014296±01516047<0001MB468117±016418±02126067<0001121±015328±01116348<0001109±015368±01121147<0001107±013358±01121902<0001BT549107±015389±01818927<0001117±016289±01315343<0001117±019285±01313254<0001118±014286±01316343<0001SUM159125±019513±02325677<0001115±021411±02120758<0001118±013417±01928169<0001119±017417±02424118<0001

Table7Comparisonofmigratoryabilitybetweenvariouspaclitaxel-rersistantbreastcancerlineswithNC-shRNAtransfectionandthosewithshRNAtransfection

乳腺癌细胞株Cullin1NC⁃shRNA shRNA t值 P值Bcl⁃6NC⁃shRNA shRNA t值 P值KLF⁃6NC⁃shRNA shRNA t值 P值ALDH活性NC⁃shRNA shRNA t值 P值HMEC103±012053±004132270032115±016047±01468930002064±014123±01568740002123±015059±01447310009MCF7114±008042±00713943<0001124±012082±01739450017062±009134±01871290002134±018063±01753930006MB415109±007036±01312772<0001119±017066±01538180019056±012119±01350440007127±016075±01538580018MB436117±009067±00654770005113±019057±01640070016052±016127±01963010003125±004057±01675870002MB468106±014052±01961410004125±013061±01753770006063±017116±01336010023129±013062±01356290005BT549118±017043±01650950007115±012053±01951610007033±012125±01679670001107±014036±01264370003SUM159107±006069±00638520018112±008067±00537810019058±007127±01868430002125±013046±00577340002

注：ALDH=醛脱氢酶

3 讨论

IRAK家族是丝氨酸/苏氨酸激酶，在TLR、IL-1R介导的信号通路或炎性反应中发挥重要的正向或负向调节作用[4]。在哺乳动物中，IRAK包括4个成员，即IRAK1、IRAK2、IRAK3(IRAKM)、IRAK4，其中IRAK1、IRAK2和IRAK4在固有免疫细胞中普遍表达，而IRAK3主要在单核/巨噬细胞中表达，IRAK参与机体的免疫反应依赖于髓样分化因子88(Myd88)和β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)信号通路，Myd88介导除TLR3之外的所有上游TLRs信号，TRIF介导TLR3和部分TLR4信号，增加或减少固有免疫细胞分泌细胞因子，帮助机体有效清除外源性病原体或内源性病变细胞，如癌细胞等。目前研究结果表明，IRAK1、IRAK2、IRAK4发挥正向调节作用，IRAK3发挥负向调节作用[5]。

IRAK1是IRAK激酶家族成员，在固有免疫系统中具有重要作用，目前已发现4种剪接异构体IRAK1a、IRAK1b、IRAK1s和IRAK1c，除IRAK1c外均具有激酶活性，可在细胞质和细胞核中充当激酶和接头蛋白的作用，参与调控TLR/IL-1R信号级联反应，调节TNF-α、Ⅰ型IFN及AP-1等炎性因子的表达[6]。

在人类癌症中，IL-1信号通路和TLR-Myd88的作用机制已被详细阐述，但IRAK1在癌症中的具体功能有待进一步研究[7]。三阴乳腺癌患者癌组织IRAK1表达水平较高，与三阴乳腺癌的转移特性密切相关，IRAK1的特异性抑制剂可选择性抑制p38/MAPK信号通路，降低抗凋亡蛋白Mcl-1的表达，诱导乳腺癌细胞大量凋亡，在临床上可用于三阴乳腺癌的治疗[7]。

20世纪70年代乳腺癌的治疗以环磷酰胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶等非蒽环类为主，80年代则以阿霉素、表阿霉素为代表的蒽环类联合化疗药物为主，90年代紫杉类药物的问世被称为肿瘤化疗的重大突破，其代表药物是紫杉醇和多西紫杉醇[8]。研究结果表明，紫杉醇是乳腺癌化疗中最有活性的药物之一，因其独特的作用机制和良好的耐受性，紫杉醇又被广泛用于与蒽环类、吉西他滨、铂类、Herceptin联合应用[9]。

三阴乳腺癌占乳腺癌的15%～20%，易复发、转移，预后差，化疗只对少部分患者有效，一旦癌细胞获得耐受性，患者极易复发并发生恶性转移，与其他类型乳腺癌相比，三阴乳腺癌患者存活率极低，病死率极高[10]。目前，治疗三阴乳腺癌的方法有限。因此，研发新型的治疗策略对治疗三阴乳腺癌转移后复发和化疗耐受性具有极其重要的意义。

炎性因子和趋化因子参与癌症发生、发展的很多阶段，如癌症起始、转移和化疗耐受性，包括核因子(NF)-κB、JAK/STAT和IFN等。在三阴乳腺癌中，NF-κB信号通路通过自分泌和旁分泌通路活化普遍存在，促进下游炎性因子的分泌如IL-6、IL-8和CXCLs的表达，促进下游抗凋亡基因的表达，最终导致癌细胞恶性增长和转移、癌症干细胞富集和化疗耐受性[11]。

已有研究报道，抑制IRAK1、IRAK4的药物可用于治疗骨髓增生异常综合征和急性淋巴性白血病，效果显著[12]，但IRAK1在三阴乳腺癌中的作用及其与紫杉醇耐受性的关系还未得到明确阐述。

紫杉醇被广泛应用于术后辅助治疗乳腺癌，其化学结构独特、抗肿瘤谱广，活性高且单药缓解率可达40%～68%，疗效确切，可耐受毒性反应。紫杉类药物是通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂，对肿瘤细胞产生抑制和杀伤作用，是目前治疗乳腺癌最有效的药物之一，可显著改善早期乳腺癌患者的无病生存期和总生存期。1994年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准紫杉醇用于治疗复发转移的乳腺癌，2000年批准用于早期乳腺癌术后的辅助治疗[13]。化疗药物抑制肿瘤细胞增殖的机制有：直接杀伤肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞分化，诱导肿瘤细胞凋亡。在G2/M期，紫杉醇通过促进微管聚集、阻止微管解聚，从而抑制细胞分裂。但是紫杉醇治疗乳腺癌尤其是三阴乳腺癌，会导致骨髓抑制和紫杉醇耐受性[14]。

乳腺癌紫杉醇耐受与IRAK1密切相关，涉及的下游信号通路主要包括NF-κB和p38-Mcl-1信号通路，前者主要负责富集癌症干细胞，后者主要负责紫杉醇耐受，增加乳腺癌细胞存活率。p38/JNK信号通路可磷酸化并稳定Mcl-1，促进癌细胞抗凋亡的效果[15]。因此，在三阴乳腺癌治疗领域，与单独抑制NF-κB信号通路相比，抑制IRAK1可同时抑制NF-κB和p38/JNK信号通路，具有更好的临床治疗效果。磷酸化的IRAK1与三阴乳腺癌化疗后复发有关，而使用IKKβ/RelA抑制剂抑制NF-κB信号通路来治疗三阴乳腺癌，毒副作用大。因此，IRAK1抑制剂是治疗三阴乳腺癌的最佳选择，可通过诱导癌细胞大量凋亡阻断乳腺癌紫杉醇耐受[7]。本研究结果表明，各类型乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1相对表达水平均高于不耐受患者，三阴乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1相对表达水平均高于其他类型乳腺癌紫杉醇耐受患者。

三阴乳腺癌患者服用紫杉醇后，可激活STAT3、转化生长因子β(TGF-β)和缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路，血清中IL-6和IL-8水平升高，诱发一系列炎性反应。本研究结果表明，除以上信号通路外，紫杉醇还可激活IRAK1信号通路，IRAK1可显著增加NF-κB信号通路相关的炎性因子如IL-6、IL-8和CXCL-1的表达，促进三阴乳腺癌细胞生长、转移、耐受性和癌症干细胞的表型。乳腺癌细胞增殖相关基因主要包括Cyclin D1、PCNA、Cyclin A。本研究显示，经抑制IRAK1表达的序列shRNA转染后，紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株Cyclin D1、PCNA、Cyclin A相对表达水平降低。

ALDH可用于区分正常乳腺细胞和癌细胞，其活性可使用ALDEFLUOR试剂来检测，ALDEFLUOR阳性的细胞与癌症干细胞的行为相同，在乳腺癌发生、发展和恶性转移过程中发挥重要作用[16]。紫杉醇处理乳腺癌细胞株后，ALDH活性增强，但当IRAK1被shRNA下调后，这种现象显著减弱。本研究结果表明，经抑制IRAK1表达的序列shRNA转染后，紫杉醇耐受的各乳腺癌细胞株ALDH活性下降。

Cullin 1是E3泛素连接酶SCF复合物的主要支架之一，该家族高度保守，主要包括Cullin 1、Cullin 2、Cullin 3、Cullin 4A、Cullin 4B、Cullin 5和Cullin 7，与多种细胞的迁移有关，如胚胎滋养层细胞、肝癌细胞、鳞状细胞癌细胞、肾上腺皮质腺瘤细胞、儿童成神经管细胞瘤细胞、恶性胸膜间质瘤细胞等[17]。本研究显示，采用shRNA抑制IRAK1后，Cullin 1表达水平下降，紫杉醇耐受的乳腺癌细胞株的迁移能力显著降低。

研究报道Bcl-6可促进乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移，是乳腺癌细胞迁移能力的标志物[18]，KLF6可抑制细胞增殖和迁移[19]。本研究结果表明，在紫杉醇耐受的乳腺癌细胞株中抑制IRAK1，可显著降低Bcl-6的表达，促进KLF6的表达，最终抑制乳腺癌细胞的迁移。

综上所述，IRAK1在紫杉醇耐受的乳腺癌细胞，尤其是三阴乳腺癌细胞中发挥重要作用，抑制IRAK1表达可显著降低乳腺癌细胞的增殖和迁移能力，诱导癌细胞凋亡。IRAK1在固有免疫系统中位于TLR信号通路下游，主要通过TRIF和Myd88调控下游的NF-κB和p38-Mcl-1信号通路，抑制IRAK1可同时降低NF-κB和p38-Mcl-1两个信号通路的活性，这可能是IRAK1抑制剂降低乳腺癌耐受紫杉醇能力，降低癌细胞增殖和迁移能力，促进癌细胞凋亡的机制。因此，IRAK1抑制剂可用于乳腺癌尤其是三阴乳腺癌的治疗，对改善乳腺癌患者预后具有重要意义。

作者贡献：施华球进行课题设计与实施、资料收集整理、成文并对文章负责；谢瑞莲进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：吴立波)

Mechanisms of Interleukin-1 Receptor-associated Kinase 1 in the Treatment for Breast Cancer Patients with Resistance to Paclitaxel

SHIHua-qiu*,XIERui-lian

DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou341000,China

*Correspondingauthor：SHIHua-qiu,Associateprofessor;E-mail：249870475@qq.com

Objective To investigate the mechanisms of interleukin-1 receptor-associated kinase 1(IRAK1) in the treatment for breast cancer patients with resistance to paclitaxel.Methods From May 2013 to September 2015,the Department of Oncology,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,collected breast tissues of 16 control female(breast fibrous tumor) and those of patients with differential subtypes of breast cancer,including 38 Basal-like breast cancer,25 Luminal-A breast cancer,31 Luminal-B breast cancer,31 HER2 overexpressed breast cancer,and 58 TNBC breast cancer.The relative expression level of IRAK1 mRNA in controls and different breast cancer patients were measured by real-time PCR.The level of inflammatory cytokines such as IL-6,IL-8,CXCL-1 were detected by ELISA.Breast cancer cell lines(HMEC,MCF7,MB415,MB436,MB468,BT549 and SUM159) were cultured.Through low concentration gradient increment combined with large dose intermittent shock,breast cancer cell lines obtained resistance to paclitaxel.The relative expression level of IRAK1 mRNA of various breast cancer cell lines with resistance to paclitaxel and without paclitaxel treatment were measured by real-time PCR.When breast cancer cell lines with resistance to paclitaxel were transfected by shRNA or blank sequence NC-shRNA,real-time PCR was performed to detect the relative expression level of proliferation-associated genes such as Cyclin D1,PCNA and Cyclin A,that of apoptosis-related genes such as p53,c-myc,Bcl-2 and c-erb-2,and that of migration-related genes such as Cullin 1,Bcl-6 and KLF6.ALDEFLUOR testing was used to detect the activity of aldehyde dehydrogenase(ALDH).Results The relative expression level of IRAK1 mRNA in various subtypes of paclitaxel-resistant breast cancer patients was much higher than that of the non-resistant patients(P<0.05).The relative expression level of IRAK1 mRNA in paclitaxel-resistant TNBC was higher than that of other subtypes of paclitaxel-resistant patients(P<0.05).The differences in the expression levels of IL-6,IL-8 and CXCL-1 between the controls and the various paclitaxel-resistant breast cancer patients showed statistical significance(P<0.05).The relative expression level of IRAK1 mRNA in various subtypes of paclitaxel-resistant breast cancer cell lines was higher than that of the cell lines without paclitaxel treatment(P<0.05).Compared with the paclitaxel-resistant breast cancer cell lines with NC-shRNA transfection,the various paclitaxel-resistant breast cancer cell lines with shRNA tranfection had lower Cyclin D1,PCNA,Cyclin A,Cullin 1 and Bcl-6 relative expression levels and lower ALDH activity,but higher p53,c-myc,Bcl-2,c-erb-2 and KLF6 relative expression levels(P<0.05).Conclusion IRAK1 plays an essential role in paclitaxel-resistance breast cancer cells especially in TNBC.When the expression of IRAK1 was inhibited,the proliferation and migratory ability could be remarkably decreased inducing abundant breast cancer cell apoptosis,so IRAK1 inhibitors could be used in breast cancer therapy especially in TNBC.

Breast neoplasms；Drug resistance,neoplasm；Interleukin-1 receptor-associated kinases；Cell proliferation；Apoptosis

R 737.9

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.02.009

2016-06-17；

2016-11-15)

341000江西省赣州市，赣南医学院第一附属医院肿瘤科

*通信作者：施华球，副教授；E-mail：249870475@qq.com