一株引起鸡白痢鸡伤寒平板凝集实验阳性的奇异变形杆菌的分离鉴定

周云锋+褚欧成+边海霞+郭磊++王学强+王洁+王翔

摘要：从宁夏某养殖场鸡白痢鸡伤寒多价平板凝集抗原阳性鸡只的肠道中分离到一株革兰氏阴性杆菌，经 16S rRNA 测序鉴定为奇异变形杆菌；通过对该菌株进行人工感染健康鸡只，成功复制出与自然感染相同的病例。

关键词：鸡白痢；鸡伤寒；变形杆菌的分离

中图分类号： S858 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.01.016

鸡沙门氏菌病 OIE 规定的标准诊断方法：病原鉴定。采取检测样本，通过选择性培养基分离、培养细菌，还有沙门氏菌复苏试验，都可以从病原学上鉴定、验证鸡沙门氏菌病；血清学试验。利用沙门氏菌抗原，通过快速全血凝集试验、快速血清凝集试验、试管凝集试验、微量凝集试验等检测样本中的抗体，达到诊断的目的。但我国国标对鸡白痢伤寒检测采用平板凝集实验，实验方法随着细菌的变异准确性越来越低，经实践证明有多种细菌感染均会引起平板凝集阳性，其中包括奇异变形杆菌。

奇异变形杆菌（proteusmirabilis，PM）属于肠杆菌科变形杆菌属，是革兰氏阴性运动细菌，有鞭毛，是人和动物的寄生菌和病原菌；广泛分布于人和动物的体表、黏膜及消化道，其产生的毒素可引起中毒，是一种常见的条件性致病菌[1]，当机体抵抗力降低时容易引起发病。鸡奇异变形杆菌病是近年来新发生的一种鸡群的细菌性传染病，各种日龄的鸡均可感染，但以 7 周龄以下的雏鸡最易感，病死率可高达 50%以上；育成鸡及成年产蛋鸡均易感但发病率与病死率一般很低。该病作为一种不常暴发的新的细菌性传染病，可造成较高的死亡，而愈后的雏鸡生长速度变慢，导致雏鸡的大批死亡，造成很大的经济损失，因此应引起养鸡业的高度重视[2]。

近年来，有少量文献报道[3]奇异变形杆菌与沙门氏菌属具有共同抗原，能够与沙门氏菌属的多价血清和因子血清发生交叉凝集，引起菌种鉴定上的困难。但能引起鸡白痢鸡伤寒多价平板凝集抗原阳性反应的未见报道，本实验室在分离沙门氏菌时偶然发现其能引起鸡白痢鸡伤寒多价平板凝集抗原阳性反应，且在反应时间和形成的凝结块上根本无法进行区分，经病例复制实验证实，该菌正是造成鸡只鸡白痢鸡伤寒多价平板凝集抗原假阳性反应的病原菌。

1 材料与方法

1.1 被检材料

宁夏某鸡场 110 日龄育成鸡，经鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌多价抗原平板凝集实验检测的阳性鸡只，无临床症状。

1.2 培养基及主要试剂

缓冲蛋白胨水、SC 增菌液、氯化镁孔雀绿肉汤、普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基、SS 琼脂平板、LB 肉汤、XLT4 培养基等均购自北京路桥技术有限公司；细菌生化微量鉴定管购自青岛海博生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒、Taq 聚合酶及配套 dNTP 等试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 实验动物

健康鸡只：55 日龄海兰褐母鸡购于宁夏晓鸣农牧股份有限公司。

1.4 细菌分离和鉴定

无菌剖检鸡只，采集肠道后段、肝脏、胆囊、肺脏、肾脏、输卵管各部分，分别接种于缓冲蛋白胨水中，37℃培养20时，预增菌；将预增菌的培养物转分别接到 SC 增菌液和氯化镁孔雀绿肉汤中 37℃增菌24时，增菌后分别划线于 SS 琼脂、麦康凯培养基、SS 琼脂平板、普通营养琼脂培养基，分别挑取优势菌落进行纯培养，得到的纯培养物命名为 NX-1，将得到的纯培养物涂片后进行革兰氏染色和硝酸银染色，显微镜（40×100）观察。

1.5 生化鉴定

将 NX-1 分别接种到沙门氏菌微量生化鉴定管，37℃培养 24小时，观察记录结果。

1.6 16S rRNA 的扩增及序列测定

挑取 NX-1 少许，移入 LB 肉汤液体培养基扩大培养 10h，取新鲜菌液 1毫升，离心收集菌体，用 DNA 提取试剂盒抽提 NX-1 细菌的基因组 DNA。采用细菌通用引物序列 27F/1492R（由上海生工合成）。

反应体系为 50uL 反应体系：10 X Buffer 5uL， dNTP（10 mmol/L） 4uL，Taq DNA 聚合酶 0.5uL，上、下游引物各 2uL，模板 DNA2uL。反应条件：95℃预变性5分钟；94℃ 45秒，57℃ 45秒，72℃ 2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。

取 5uL PCR 产物用 0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用 DNA Marker 作为参照。选取目的条带送上海生工进行序列测定。

1.7 病例复制

将 50 只 55 日龄海兰褐母鸡随机分为2大组，第 1 组内分成注射组、饲喂组和对照组；第2组分为注射组和对照组，每小组10只健康鸡只，用鸡白痢鸡伤寒多价抗原平板凝集实验剔除陽性鸡只，单独饲养10天后再次剔除阳性鸡只。

第1组内每小组间隔3米，不做隔离；第 2 组注射组和对照组严格隔离。注射组每只接种 NX-1 浓缩液1mL（菌液浓度均调整到9×1010 cfu/mL的生理盐水）；对照组每只接种 1mL 生理盐水；饲喂组饲喂含NX-1的饲料2天（菌液浓度均调整到9×1010cfu/g）；接种后每天观察记录。

2 结果

2.1 细菌分离及染色观察

仅从鸡只的肠道中分离到该菌，其他组织均无此菌生长，37℃培养 16小时，普通琼脂培养基上菌落呈扩散状生长布满整个平皿。在麦康凯平板上，长出均匀一致的圆形、透明、无色菌落。在 SS 培养基上形成中间黑色周围无色透明的菌落。 XLT4 上面形成黑色中心的透明菌落。

镜检结果显示：革兰氏阴性、杆菌，多为单个存在（有短链状，2～4 个菌体链），短杆状；硝酸银染色可见周身鞭毛。

2.2 细菌生化鉴定

在三糖铁斜面培养基上，底部产酸，斜面产碱，硫化氢强阳性；氧化酶阴性、分解葡萄糖产酸产气、不分解乳糖、苯丙氨酸脱氨酶阳性、氰化钾抑制试验阳性，鸟氨酸脱竣酶阳性；靛基质、赖氨酸脱竣酶、甘露醇、山梨醇 ONPG 均为阴性，与说明书对比判断该菌非沙门氏菌。

2.3 16Sr RNA 鉴定

该菌 16S rRNA 基因 PCR 擴增结果显示，均扩增出约 1400bp 的片段，与预期片段大小一致。测序结果显示，该 NX-1 分离菌的16S rRNA扩增片段为1368bp，经 Blast 分析比对，发现与其匹配度最高的几种全序列均是奇异变形杆菌各株系的 16S rRNA 序列，其匹配度高达 99%，进一步证实该分离菌为奇异变形杆菌。

2.4 病例复制实验

实验过程中未见鸡只死亡，在接种12时，鸡只出现轻度腹泻，20小时后逐渐好转；实验第11天剖检第2组鸡只出现阳性转为阴性，因此剖检注射组5只（3只转阴性鸡只、2 只阳性鸡只）、对照组4只进行对比，未发现明显剖检变化。鸡白痢鸡伤寒多价平板凝集实验结果，见表1。

3 结语

鸡奇异变形杆菌病是近年来国内新发现的一种急性细菌性传染病，主要引起禽类腹泻、菌血症、泌尿系统感染等疾病。本研究从鸡白痢鸡伤寒假阳性健康鸡只中分离到 1 株奇异变形杆菌，鸡群无明显腹泻等症状；人工感染实验成功复制出与自然感染相同的病例，在人工感染后 12小时出现轻度腹泻，但很快就会好转（8小时），无其他症状，剖检未发现与对照组有明显差异，水平传播能力强。该菌株在 SS 培养基上传代 10 次以后毒力减弱，接种健康鸡只后仅见 20%弱阳性鸡只。

参考文献

[1]连琼兰.一起雏鸡奇异变形杆菌病的诊治[J].福建畜牧兽医，2015（04）：61-62.

[2]衣菲，于申业，田秋丰，等.禽源奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2015（01）：121-122，126，216.

[3]王锦彤，钟广辉，熊定凯，等.珠江水中检出与沙门氏菌具有共同抗原的奇异变形杆菌[J].口岸卫生控制，2008（02）：23-24.

作者简介：周云锋，硕士，主任助理，研究方向：疾病诊断和家禽养殖。