基于psbAtrnH序列DNA条形码技术的绵马贯众鉴定研究

蔡振娇吴亚男　许亮　赵容　王冰　康廷国

[摘要] 利用psbAtrnH序列对绵马贯众药材、基原植物进行真伪鉴定。对实验样本的psbAtrnH序列进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增及产物测序，为扩大研究范围，从GenBank中下载了3属8种植物的psbAtrnH序列。利用DNAMAN 8.0软件进行峰图的查看、拼接及比对，使用MEGA 6.0软件计算K2P遗传距离并建立系统聚类树对其进行分析。结果显示psbAtrnH序列可对绵马贯众、其基原植物粗茎鳞毛蕨，以及同科属植物进行鉴别，其中绵马贯众与其基原植物粗茎鳞毛蕨的psbAtrnH序列完全一致，并可与其他易混药材及植物明显区分。表明psbAtrnH序列对绵马贯众药材、基原植物及其混伪品的鉴别具有可行性，为后续蕨类药材的鉴定研究提供一定的科学基础。

[关键词] psbAtrnH序列； 绵马贯众； 粗茎鳞毛蕨

Identification of Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma

based on psbAtrnH barcode

CAI Zhenjiao1， WU Yanan2， XU Liang1*， ZHAO Rong1， WANG Bing1， KANG Tingguo1

（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China；

2.Central Hospital of Changtu County， Changtu 112500， China）

[Abstract] To identify origin of the medicinal materials Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma by using the psbAtrnH sequence， the polymerase chain reaction （PCR） amplification and product sequencing of the experimental samples were performed. In order to expand the scope of the study， the psbAtrnH sequences of 8 genera and 3 species were downloaded from GenBank for analysis. DNAMAN 8.0 software was used to show splicing and comparison results of the peak diagrams with analysis of them， and MEGA 6.0 software was to calculate K2P genetic distances and establish clustering tree adjacent genus. The results showed that by using the psbAtrnH sequence， Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma， its original plant and other easyconfused medicinal materials and plants can be distinguished with each other obviously， with the psbAtrnH sequence of Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma completely consistent with that of its original plant. Consequently， it is revealed that it′s feasible to identify Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma and its original plant， and separate from its adulterants by means of the psbAtrnH sequence， which can provide more scientific bases for the further study of the identification of the ferny medicinal herbs.

[Key words] psbAtrnH sequences； Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma； Dryopteris crassirhizoma

doi：10.4268/cjcmm20162216

绵马贯众为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨Dryopteris crassirhizoma Nakai的干燥根茎和叶柄残基。有清热解毒，驱虫的功效，用于虫积腹痛，疮疡。主要分布于东北三省及周边地区[14]。市场上流通大量的混伪品[56]，应用传统鉴别方法存在一定的难度，化学成分鉴别亦有学者进行了研究[711]；考虑DNA分子鉴别技术的准确性、客观性，故本研究采用DNA分子鉴别技术对其进行研究，结果表明其具有很好的鉴别可行性。

DNA条形码分子鉴定是根据基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列对物种进行鉴定，与传统的鉴定方法相比，DNA分子标记技术具有特异性强、便捷、准确等特点，已被《中国药典》2015年版收载，并指出植物类药材DNA条形码鉴定以ITS2为主，psbAtrnH 为辅[1213]。刘锋等[14]应用psbAtrnH序列对鳞毛蕨属贯众药材基原植物进行了研究，其研究内容为鳞毛蕨属植物，本文在此基础上扩大研究范围，对东北分布的鳞毛蕨属、耳蕨属及复叶耳蕨属植物进行了研究，并首次对同一植株的绵马贯众药材、叶片进行了DNA条形码分子鉴定。本研究应用psbAtrnH序列对绵马贯众药材、基原植物及其混伪品进行鉴定，为准确、便捷的鉴定绵马贯众药材提供重要的分子依据，同时为后续蕨类药材的分子鉴定研究提供一定的科学基础。

1 材料

H/T16MM台式高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）、HHZK 型数显恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）、MG96G 型PCR 仪（杭州朗基科学仪器有限公司）、EPS600型电泳仪（上海天能科技有限公司）、Tanon4100凝胶图像处理系统（上海天能科技有限公司）、ABI 3730XL型测序仪（美国Applied Biosystems 公司）。

离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）、Taq Master Mix（北京康为世纪）、引物（北京华大基因公司）、Trans5k DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司）、琼脂糖、EB （上海生物工程股份有限公司），其余试剂均为分析纯。

样本来源见表1，包括实验样本和下载于GenBank 的序列，共3属8个物种44个样本及一外类群样本，其中鳞毛蕨属植物4种，耳蕨属植物3种及复叶耳蕨属植物1种，对绵马贯众的实验研究包含来源于同一植株的叶片及药材。实验样本保存于辽宁中医药大学药用植物教研室；下载于GenBank 的序列经相似性搜索法BLAST鉴定与实验样本为同一物种或为其近缘种。

2 方法

2.1 DNA 提取、PCR扩增及产物测序 选取硅胶干燥的植物叶片、干燥的药材粉末约30 mg，使用植物基因组DNA 提取试剂盒进行总DNA的提取，具体步骤按照试剂盒操作说明进行。psbAtrnH 序列扩增正向引物：5′GTTATGCATGAACGTAATGCTC3′，反向引物：5′CGCGCATGGTGGATTCACAATCC3′。PCR 扩增体系为50 μL，含有正反引物各2.0 μL（2.5 μmol·L-1），Taq MasterMix 25 μL，总DNA 4.0 μL（约40 ng），加去RNA 酶水补足至50 μL[15]。扩增程序为94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min（35个循环）；72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物经纯化后进行双向测序。

2.2 数据处理 测序后所得的序列峰图可利用DNAMAN 8.0 软件进行查看、拼接校对，去除低质量的序列及引物区，以碱基质量不低于20为标准。使用MEGA 6.0（molecular evolutionary genetics analysis）软件进行分析比对，计算遗传距离（K2P）并对其他数据进行分析和处理。利用邻接法（neighborjoining，NJ）构建系统进化树和相似性搜索法BLAST 进行序列的比对，鉴定分析各样本[1518]。

3 结果与分析

3.1 psbAtrnH序列物种鉴定分析 3属8物种36个样本及一个外类群样本psbAtrnH序列的琼脂凝胶电泳检测的PCR扩增结果见图1。本研究中，总DNA提取的成功率为100%；psbAtrnH序列对包含外类群在内的37个实验样本的PCR扩增成功率为100%；测序成功率及序列获得率均为100%。对所得峰图的分析可知，各序列的碱基质量值均>20。

3.2 种内和种间变异 3属8个物种44个样本的psbAtrnH序列长度为429～542 bp。应用MEGA 6.0软件进行多序列的比对，不同物种间的信息位点有41个，碱基变异位点有43个。其中来源于同一植物的粗茎鳞毛蕨干燥叶片与绵马贯众药材的psbAtrnH序列完全一致，且与GenBank下载这一植物的序列相同，其他各植物获得序列亦与GenBank下载的植物序列相一致；psbAtrnH序列种间遗传变异（0.002 3～0.066 4）大于绵马贯众的种内遗传变异（0.000 0），见图2，表2。

3.3 NJ 树聚类分析 基于psbAtrnH序列构建的NJ系统聚类树见图3，结果显示实验样本被聚为两大支。鳞毛蕨科3属8个物种44个样本被聚为一大支，与外类群分开。其中复叶耳蕨属植物聚为一支，鳞毛蕨属和耳蕨属聚为一大支，且两属植物分别聚为一小支。鳞毛蕨属植物中，绵马贯众药材与其基原植物粗茎鳞毛蕨聚为一支，表明该序列对药材及其基原植物均可进行有效鉴别；同时二者与同属植物山地鳞毛蕨D. Monticola、东北亚鳞毛蕨D. coreanomontana和欧洲鳞毛蕨D. filixmas较好区分；东北亚鳞毛蕨D. coreanomontana与欧洲鳞毛蕨D. filixmas聚在一起，表明二者具有较近的亲缘关系。同属不同物种均单聚为一小支，表明psbAtrnH序列对其具有较佳的鉴别能力。

4 讨论

参考《中国药典》[1]2015年版对DNA条形码分子鉴别的记载，及陈士林[19]《中药DNA条形码分子鉴定》一书，本文亦对实验样本进行了ITS2序列的研究，选取ITS2序列扩增正向引物ITS2F：5′ATGCGATACTTGGTGTGAAT3′，反向引物ITS3R：5′GACGCTTCTCCAGACTACAAT3′进行研究，在此基础上对PCR扩增体系和退火温度等条件进行了筛选，成功进行了PCR扩增反应，表明此对引物并不适用于绵马贯众药材及其基原植物的鉴定研究，进一步证明应用psbAtrnH序列对绵马贯众进行鉴别研究具有实际意义。同时，为后续蕨类植物的DNA条形码鉴别研究提供一定的科学基础。

目前市场流通的绵马贯众商品来源复杂，药典收载和非药典收载种混乱，因此建立有效的中药绵马贯众物种的鉴定方法十分必要，本研究结果分析了DNA 条形码技术应用于中药材鉴定中被广泛关注的问题，证明了psbAtrnH序列作为DNA 条形码能稳定、准确鉴别绵马贯众药材，为保障临床安全用药提供了新的技术手段。

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[责任编辑 吕冬梅]