龙骨马尾杉PcHDR1基因克隆及序列分析

张志利　吕海舟　郭溆　何柳　宋经元　孙超　罗红梅

[摘要] 该研究采用RTPCR方法对龙骨马尾杉Phlegmarirus carinatus （Desv.） Ching 1羟基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸还原酶[1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase， HDR]基因PcHDR1的编码区进行克隆并利用生物信息学方法进行序列分析。根据实验室已获得的龙骨马尾杉转录组数据，从中获得1条编码HDR的转录本，采用RTPCR方法获得该基因的全长cDNA序列，所克隆的PcHDR1基因编码区长为1 437 bp，编码478个氨基酸残基，GenBank登录号为JQ957845。PcHDR1与银杏Ginkgo biloba的HDR序列同源性最高，达78%。生物信息学预测PcHDR1蛋白没有跨膜区，具有LytB保守结构域，不含信号肽。该研究克隆并获得了龙骨马尾杉PcHDR1基因的编码区序列，并对其编码的蛋白进行了序列分析及结构域预测，为进一步研究HDR的功能奠定基础。

[关键词] 1羟基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸还原酶； 龙骨马尾杉； 萜类生物合成

Cloning and bioinformatics analysis of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl

4diphosphate reductase（PcHDR1）gene in Phlegmarirus carinatus

ZHANG Zhili1，2， LV Haizhou1， GUO Xu1， HE Liu1， SONG Jingyuan1， SUN Chao1， LUO Hongmei1*

（1. Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Institute of Medicinal

Plants/Endangered Medicinal Breeding National Engineering Laboratory， Beijing 100193， China；

2. College of Horticulture and Gardening， Yangtze University， Jingzhou 434025， China）

[Abstract] The open reading frame of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase （HDR） was cloned from Phlegmarirus carinatus by RTPCR method and the sequence was analyzed by bioinformatics tools. After searching the transcriptome dataset of P. carinatus， one unique sequence encoding 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase was discovered. The primers were designed according to the cDNA sequence of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase from the dataset. And then， the open reading frame （ORF） of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase， named as PcHDR1 （GenBank Accession number：JQ957845）， was cloned by RTPCR strategy with the template of mixed RNA extracted from roots， stem and leaf of P. carinatus. The bioinformatic analysis of this gene and its corresponding protein was performed. The ORF of PcHDR1 consisted of 1 437 base pairs （bp）， encoding one polypeptide with 478 amino acids. The sequence comparison showed that PcHDR1 is closest with GbHDR （Ginkgo biloba），and the sequence homology was up to 78%. Bioinformatics prediction and analysis indicated that PcHDR1 protein contained a conserved domain of LytB， without transmembrane region and signal peptides. This study cloned and analyzed 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase from P. carinatus. The result will provide a foundation for exploring the function of PcHDR1 involved in terpene biosynthesis in P. carinatus plants.

[Key words] 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase； Phlegmarirus carinatus； terpene biosynthesis

doi：10.4268/cjcmm20162214

龙骨马尾杉Phlegmarirus carinatus（Desv.） Ching是石杉科马尾杉属的代表物种[1]。龙骨马尾杉中含有石松生物碱（lycopodium alkaloids）、萜类（triterpenes）、有机酸（phenolic acids）和黄酮（flavones）等多种成分[23]，全草入药，具有重要药用价值。对风湿关节痛、类风湿性关节炎、筋骨疼痛、跌打损伤等具有显著疗效。龙骨马尾杉为多年生的附生植物，且生境极为特殊，导致龙骨马尾杉的野生资源极为有限。因此通过分子生物学手段挖掘龙骨马尾杉中与次生代谢相关的基因显得尤为重要。

萜类物质是自然界存在的一类由异戊二烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate， IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dmiethylallyl diphosphate， DMAPP）为基本骨架组成的化合物的统称，也称为类异戊二烯。该类化合物有很好的药理活性，是中药和天然药物的主要有效成分，紫杉醇[4]、青蒿素[5]、银杏内酯[6]等都属于萜类，因此萜类化合物的合成代谢引起了人们广泛的关注。甲基赤藓糖磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途径[78]是一条存在于植物和细菌中的参与萜类前体物质合成的途径，位于质体中。MEP途径中最后一个限速酶是1羟基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸还原酶[1hydroxy2methyl 2（E）butenyl 4diphosphate reductase，HDR][9]， 催化羟甲基丁烯基4磷酸（hydroxymethylbutenyl 4d iphosphate，HMBPP） 生成萜类合成的前体物质——IPP 和DMAPP。2000年，Cunningham等通过在大肠杆菌中表达金盏花Adonis aestivalis的lytB 基因，第1次证明了该基因编码的蛋白具有HDR蛋白的功能，并可以维持IPP和DMAPP恒定的5∶1的比例[10]。 2004年，BotellaPavía P通过在转基因拟南芥中过表达HDR和TXS（taxadiene synthase）基因发现，在该转基因植株中紫杉二烯的含量比单转TXS的拟南芥提高13倍[11]。该基因广泛存在于生物体中，在植物、细菌和真菌中均已发现。Lv等在蛇足石杉中克隆了该基因家族的2个成员——HsHDR1和HsHDR2[12]。HDR是萜类物质生物合成中的1个限速酶，在萜类合成中行使调节萜类合成前体五碳分子库容的重要功能，是萜类代谢工程中重要的功能蛋白，它的超量表达有利于推动代谢流向下游流动， 促进下游相关产物的生物合成。因此，对研究生物代谢工程具有重要意义。

本实验室已经获得了大量的龙骨马尾杉转录组信息，从中发现了大量可能参与龙骨马尾杉萜类化合物生物合成的转录本[13]。本文克隆了龙骨马尾杉PcHDR1的cDNA序列，并进行了生物信学预测及分析，为阐明龙骨马尾杉萜类化合物生物合成途径奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

龙骨马尾杉P. carinatus全草采集方法同文献[13]。大肠杆菌DH5α感受态购于北京全式金生物科技有限公司。植物多糖多酚核糖核酸（RNA）提取试剂盒购于百泰克生物公司。PrimeScript反转录试剂盒、Pyrobest高保真酶、pMD19T vector、SYBRPremix Ex TaqTM试剂盒均为日本宝生物公司产品。多聚酶链式反应（PCR）产物胶回收试剂盒购于天根生物公司。本研究所用引物均由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯，试剂与仪器同文献[13]。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

取适量龙骨马尾杉全草，在液氮中研磨，依据百泰克生物公司的植物多糖多酚核糖核酸（RNA）提取试剂盒的操作步骤提取龙骨马尾杉总RNA，RNA完整性检测及RNA反转录合成第一链互补链DNA（cDNA）的方法同文献[13]。

1.3 PcHDR1基因的扩增及测序

以龙骨马尾杉的cDNA为模板，按照以下体系对龙骨马尾杉的PcHDR1基因进行扩增：cDNA 1.0 μL，Pyrobest酶0.2 μL，10 μmol上下游引物各1.0 μL，2 mmol·L-1 dNTP 0.5 μL，10×Pyrobest Buffer 3.0 μL，终体积为30.0 μL。反应程序：94 ℃预变性3 min，然后进行30个循环，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循环结束后72 ℃ 7 min延伸反应，10 ℃保温。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对扩增所得目的片段进行切胶回收。引物序列见表1。

将回收产物与pMD19T载体连接，转化DH5α菌株，在含有氨苄的LB平板上进行培养，挑取单克隆经菌落PCR扩增和电泳检测后选择阳性克隆送公司测序。

1.4 PcHDR1生物信息学分析及在线分析工具

本研究中使用的生物信息学分析工具同文献[12]。采用ExPASy Proteomics Server 提供的在线工具Protparam（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）预测PcHDR1的理化性质；利用在线工具ExPASy PROSITE （http：//www.expasy.ch/prosite/）和美国国立生物技术信息中心（NCBI）在线工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析PcHDR1蛋白质结构域。利用SWISSMODEL （http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白质二级结构。利用3DJIGSAW（http：//bmm.cancerresearchuk.org/～3djigsaw/）对PcHDR1蛋白进行同源建模，分析其三维结构。使用SignalP3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行分泌蛋白预测。WOLF PSORT （http：//wolfpsort.org/） 用于PcHDR1蛋白的定位信号预测。在线软件TMHMM Server v. 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）用来预测PcHDR1的跨膜区。氨基酸序列比对利用NCBI的蛋白质序列数据库进行。通过MEGA 5.0构建Neighborjoining系统进化树。

2 结果与分析

2.1 龙骨马尾杉PcHDR1基因的克隆

通过搜索龙骨马尾杉高通量转录组数据[13]，从中发现一个转录本（contig00710）被注释为1羟基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸还原酶（HDR）基因。经分析，发现该转录本具有一个完整的开放阅读框（open reading frame，ORF）。根据该开放阅读框的序列设计基因的全长扩增引物（PcHDR1F和PcHDR1R），以龙骨马尾杉全草RNA反转录得到的cDNA为模板，利用RTPCR技术扩增获得一条长为1 437 bp的序列，对所扩增基因命名为PcHDR1，GenBank登录号JQ957845。经PCR扩增所得的PcHDR1电泳检测情况见图1。

2.2 PcHDR1基因编码蛋白特性分析

2.2.1 理化性质分析 利用ExPASy Proteomics Server的在线软件Protparam对PcHDR1基因编码蛋白质的理化性质进行预测，结果显示PcHDR1的分子式为C2 358H3 722N630O737S16，编码478个氨基酸，相对分子质量是53.202 2 kD。等电点pI 5.49，带正电残基（Arg + Lys）为55，带负电残基（Asp + Glu）为67。该蛋白的不稳定系数（the instability index）为30.40，说明PcHDR1较稳定。脂肪系数（aliphatic index）为82.74，亲水性系数（grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.333。

2.2.2 PcHDR1二级结构分析及结构域预测 利用在线工具（http：//www.predictprotein.org/）预测PcHDR1的二级结构，发现其二级结构中α螺旋（Alpha helix）占35.77%，β折叠（beta turn）占16.53%，无规卷曲（random coil）占47.70%，见图2。InterProScan的保守结构域在线预测结果表明，PcHDR1在122～463位含有LytB保守结构域。

2.2.3 PcHDR1三维结构建模 在SWISSMODEL依据保守结构域作图工具中，预测了PcHDR1蛋白的三维结构。对PcHDR1蛋白的保守结构域的三维结构建模，结果见图3。

2.2.4 PcHDR1信号肽、亚细胞定位及跨膜区预测分析 利用SignalP3.0Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 预测PcHDR1蛋白不具有信号肽。在线工具WOLF PSORT （http：//wolfpsort.org/） 预测该蛋白的亚细胞定位情况，结果叶绿体的定位系数为8.0（chlo：8.0）；液泡的定位系数为2.0（vacu：2.0）；细胞核的定位系数为1.0（nucl：1.0）；细胞质的定位系数为1.0（cyto：1.0）；质体的定位系数为1.0（plas：1.0）。因此，PcHDR1最可能定位于叶绿体中。利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 预测PcHDR1的跨膜区。结果显示该蛋白没有跨膜区。

2.2.5 PcHDR1的氨基酸序列比对及进化分析 将PcHDR1的氨基酸序列提交到美国国立生物技术信息中心NCBI的蛋白质序列数据库（http：//

blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi）进行BLASTP搜索相似性序列，结果显示，PcHDR1与银杏（Ginkgo biloba）的HDR序列同源性最高，达78%。为了分析PcHDR1的进化情况，从NCBI的Nr数据库中选取了8个物种10条HDR序列绘制进化树。 这些序列包括银杏G. biloba的HDR（gi|82492442|），赤松Pinus densiflora的HDR（gi|183206805|），火炬松P. taeda的HDR（gi|126697262|），紫杉Taxus x media的HDR（gi|156068994|），艾菊Tanacetum parthenium的HDR（gi|353453158|），黄花蒿Artemisia annua的HDR（gi|289157416|），烟草Nicotiana langsdorffii x Nicotiana sanderae的HDR（gi|157042741|）和蛇足石杉Huperzia serrata中的2个HDR（gi|827048597| 和gi|827048599|）。进化树见图4，PcHDR1与蛇足石杉中的HDR（gi|126697262|）亲缘关系较近。序列同源性分析表明，PcHDR1与蛇足石杉中的2个HsHDR同源性高达92.76%，见图5。

3 讨论

转录组学研究是快速发现基因的有效手段。得益于生物信息学、 比较基因组学等学科与实验技术手段的快速发展，本课题组已运用高通量测序结合生物信息学分析技术对多种非模式药用植物的转录组进行了研究，并挖掘出大量参与植物次生代谢的候选基因，课题组已完成蛇足石杉[14]、人参[15]、三七[16]、银杏[17]、西洋参[18]、喜树[19]、丹参[20]等多个物种的高通量转录组测序，发现了大量的参与药用植物次生代谢途径及生长发育、抗病抗逆等相关基因，为后续研究药用植物次生代谢工程及优良品种选育奠定基础。

本研究在已有龙骨马尾杉转录组数据的基础上，克隆获得了编码龙骨马尾杉 HDR 的PcHDR1基因。与Lv等[12]报道的蛇足石杉中的HDR基因家族中的2个HDRs基因（HsHDR1和HsHDR2）相比，它们编码的蛋白质的大小相当，均在476～478 aa。对其编码的氨基酸序列进行生物信息学预测与分析，结果显示PcHDR1具有典型的 HDR 催化活性位点，亚细胞定位预测其定位于叶绿体，这与HsHDR1和HsHDR2预测定位于叶绿体的报道一致[12]，与MEP途径存在于质体中相一致。同来源于其他植物的HDR蛋白同源性较高，在系统进化树上，PcHDR1与来源于蛇足石杉的2个HDRs蛋白同源性高达92.76%，尤其与HsHDR1的亲缘关系最近，推测这2个HDR可能具有相似的功能。以上研究结果将为后续开展PcHDR1的功能验证及龙骨马尾杉萜类化合物的生物合成途径的研究奠定良好的基础。

[参考文献]

[1] 张丽兵，忆宪需. 中国石杉属（狭义）蛇足石杉组的分类研究[J].植物分类学报， 2000， 38 （1）：23.

[2] Shi H， Li Z， Guo Y W. A new serratanetype triterpene from Lycopodium phlegmaria [J]. Nat Prod Res， 2005， 19（8）：777.

[3] Tong X T， Tan C H， MA X Q， et al. Miyoshianines A and B，two new Lycopodium alkaloids from Huperzia miyoshiana [J].Planta Med， 2003， 69（6）：576.

[4] Wani M C， Taylor H L， Wall M E， et al. Plant antitumor agents. VI. Isolation and structure of taxol， a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia [J]. J Am Chem Soc， 1971， 93（9）：2325.

[5] Chen X Y， Xu Z H. Recent progress in biotechnology and genetic engineering of medieinal plants in China[J]. Med Chem Res，1996， 6：215.

[6] Cieza A， Maier P， Pppel E. The effect of ginkgo biloba on healthy elderly subjects[J]. Fortschr Med Orig， 2003， 121（1）：5.

[7] Eisenreich W， Schwarz M， Cartayrade A， et al. The deoxyxylulose phosphate pathway of terpenoid biosynthesis in plants and microorganisms[J].Chem Biol， 1998， 5（9）：221.

[8] Eisenreich W， Rohdich F， Bacher A. Deoxyxylulose phosphate pathway to terpenoids[J]. Trends Plant Sci， 2001， 6（2）：78.

[9] 廖志华. 紫杉醇前体生物合成的分子生物学和抗癌萜类吲哚生物碱的代谢工程[D]. 上海：复旦大学， 2004.

[10] Cunningham F X， Lafond T P， Gantt E. Evidence of a role for LytB in the nonmevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis[J]. J Bacteriol， 2000， 182（20）：5841.

[11] BotellaPavía P， Besumbes O， Phillips M A， et al. Regulation of carotenoid biosynthesis in plants：evidence for a key role of hydroxymethylbutenyl diphosphate reductase in controlling the supply of plastidial isoprenoid precursors[J]. Plant J， 2004，40（2）：188.

[12] Lv H， Zhang X， Liao B， et al. Cloning and analysis of 1hydroxy2methyl2（E） butenyl4diphosphate reductase genes HsHDR1 and HsHDR2 in Huperzia serrate[J].Acta Pharm Sinica B， 2015， 5（6）：583.

[13] Luo H M， Li Y， Sun C， et al. Comparison of 454ESTs from Huperzia serrata and Phlegmariurus carinatus reveals putative genes involved in lycopodium alkaloid biosynthesis and developmental regulation[J].BMC Plant Biol， 2010，10（1）：209.

[14] Luo H M， Sun C， Li Y， et al. Analysis of expressed sequence tags from the Huperzia serrata leaf for gene discovery in the areas of secondary metabolite biosynthesis and development regulation [J]. Physiol Planta， 2010，139（1）：1.

[15] Chen S L， Luo H M， Li Y， et al. 454 EST analysis detects genes putatively involved in ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng[J]. Plant Cell Rep， 2011， 30：1593.

[16] Luo H M， Sun C， Sun Y Z， et al. Analysis of the transcriptome of Panax notoginseng root uncovers putative triterpene saponinbiosynthetic genes and genetic markers[J]. BMC Genomics， 2011，12（Suppl 5）：S5.

[17] Lin X H， Zhang J， Li Y， et al. Functional genomics of a living fossil tree， ginkgo， based on nextgeneration sequencing technology[J]. Physiol Planta， 2011，143：207.

[18] Sun C， Li Y， Wu Q， et al. De novo sequencing and analysis of the American ginseng root transcriptome using a GS FLX Titanium platform to discover putative genes involved in ginsenoside biosynthesis[J]. BMC Genomics， 2010，11（1）：262.

[19] Sun Y Z， Luo H M， Li Y， et al. Pyrosequencing of the Camptotheca acuminata transcriptome reveals putative genes involved in camptothecin biosynthesis and transport[J]. BMC Genomics， 2011，12（1）：533.

[20] 李滢，孙超，罗红梅， 等. 基于高通量测序454 GS FLX 的丹参转录组学研究[J].药学学报， 2010， 45 （4）：524.

[责任编辑 孔晶晶]