改良脊髓半横断损伤大鼠模型的建立及评价

孙德日，胡慧媛，朱悦

（中国医科大学1.附属第四医院骨科，沈阳 110032；2.药学院药物毒理学教研室，沈阳 110122；3.附属第一医院骨科，沈阳 110001）

改良脊髓半横断损伤大鼠模型的建立及评价

孙德日1，胡慧媛2，朱悦3

（中国医科大学1.附属第四医院骨科，沈阳 110032；2.药学院药物毒理学教研室，沈阳 110122；3.附属第一医院骨科，沈阳 110001）

目的 建立一种损伤更小、存活率更高、适用范围更广的改良的脊髓半横断损伤大鼠模型。方法 将20只雌性Sprague⁃Dawley大鼠随机分为常规脊髓半横断模型组和改良脊髓半横断模型组，分别采用常规和改良的脊髓半横断法制备大鼠脊髓损伤模型，分别于术后1 d、3 d、1周和2周通过Basso⁃Beattie⁃Bresnahan（BBB）运动功能学评分评价大鼠后肢运动功能的恢复情况，并结合手术时间、术中出血量、术中脊髓后正中线定位以及二次手术显露脊髓的成功率等主要参数，比较2组间的差异。结果 改良脊髓半横断模型组较常规脊髓半横断模型组手术时间更短，术中出血量明显减少，BBB运动功能学评分更优，术中脊髓后正中线定位更准确，二次手术显露脊髓的成功率更高。在改良的脊髓半横断模型基础上，成功建立了脊髓瘢痕组织移植模型，成功率可达70%以上。结论 改良的脊髓半横断模型在手术时间、术中出血量、运动功能学评分、术中脊髓后正中线定位及二次手术显露脊髓方面均表现出明显优势，更适用于脊髓损伤研究，尤其是非急性期脊髓损伤研究。

脊髓损伤；大鼠模型；改良

临床上脊髓损伤后很难实现功能恢复，为阐明其具体的机制，实验研究中常选择动物作为主要研究对象。因此，选择理想的动物模型是开展疾病研究的前提。理想的动物脊髓损伤模型应符合以下条件：临床相似性高，可调控性强，操作简单，可重复性好，死亡率低，并发症少［1］。目前脊髓损伤研究［2⁃3］主要采用完全横断脊髓损伤模型、半横断脊髓损伤模型、重物砸击脊髓损伤模型、化学损伤脊髓损伤模型以及缺血性损伤、压迫损伤、钳夹及火器伤等脊髓损伤动物模型，分别用来模拟不同条件下的脊髓损伤。不同损伤方法对脊髓造成的损伤程度有所不同，研究者可以根据研究目的选择不同的模型制备方法［4⁃5］。上述动物模型的制备过程中多数需要咬除椎板，显露脊髓，然后再分别进行不同的损伤处理［6］。而且主要是在制备脊髓损伤模型的同时给予干预措施，这并不符合临床实际治疗情况。临床上多数病例很难有机会在脊髓损伤的同时进行治疗，所以非急性期脊髓损伤的动物模型更接近临床实际情况，因此具有重要意义。

本研究在常规的脊髓半横断模型基础上进行了改良，建立了一种损伤更小、存活率更高、适用范围更广的改良的大鼠脊髓损伤模型。该模型在手术时间、术中出血量、Basso⁃Beattie⁃Bresnahan（BBB）运动功能学评分、术中脊髓后正中线定位及二次手术显露脊髓成功率方面均表现出明显的优势，取得了较为满意的结果。本研究建立的改良的大鼠脊髓损伤模型更适用于脊髓损伤研究，尤其是非急性期脊髓损伤研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及手术器材

清洁级健康成年雌性Sprague⁃Dawley大鼠，体质量200～250 g，由中国医科大学实验动物部提供。戊巴比妥钠（美国Sigma公司），红霉素软膏（北京双吉制药），0.2%碘伏消毒液（辽宁卫华医药），生理氯化钠溶液（青岛仁华制药）。高压消毒锅（MLS⁃3020，日本SANYO公司），解剖显微镜（上海光学仪器厂），显微手术器械、普通手术器械、大鼠手术操作台（上海手术器械厂）。

1.2 动物模型的建立及分组

将20只雌性Sprague⁃Dawley大鼠随机分为2组，每组10只。常规脊髓半横断模型组：1%戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉后，将大鼠俯卧位固定于手术操作台。背部正中皮肤备皮、常规消毒，计数肋骨定位T8水平，以此为中心，在T7～9水平对应后正中线处做纵行直切口切开皮肤，在正中线沿棘突向两侧剥离肌肉至椎板外缘，暴露并咬除T8椎板，显露脊髓，以脊髓后正中血管为标志，用11号手术刀片于大鼠T8水平横断右半侧脊髓，出血明显，彻底止血后，再次消毒，逐层缝合肌肉和皮肤，表面涂抹红霉素软膏预防感染。改良脊髓半横断模型组：麻醉、固定等步骤同常规脊髓半横断模型组。然后在T8～9水平对应后正中线处做纵行直切口切开皮肤，在正中线沿棘突向两侧剥离肌肉至椎板外缘，将T8棘突尖部剪除，保留棘突根部，可见T8～9间的黄韧带，将其切断，显露深层脊髓，提起T8棘突根部，用25号注射器针头将脊髓右侧划断，重复3次，保证半横断损伤完全，其余操作同常规脊髓半横断模型组。待大鼠清醒后放回动物室单笼饲养。大鼠清醒后可自由进食、饮水。术后每日腹腔注射80万单位青霉素钠，连续3 d，预防感染。保持饲养环境适宜的温度和湿度，保证笼具清洁及大鼠身体干燥，每日按压膀胱辅助排尿3次，直至大鼠恢复自主排尿反射。

上述2组大鼠在初次术后2周时，行二次手术显露脊髓损伤区域。麻醉、固定步骤同初次手术，备皮、消毒后，取原手术切口切开皮肤，分离肌肉及瘢痕组织，术中认真止血，小心操作，显露初次脊髓损伤区。常规脊髓半横断模型组大鼠二次显露脊髓时，咬除T7和T9椎板，分别从近、远端正常脊髓区逐渐小心向T8水平的脊髓损伤区分离，术中瘢痕出血特别明显，有些需要终止操作，部分大鼠因术中出血死亡。改良脊髓半横断模型组大鼠在显露脊髓时，在咬除T8和T9椎板后，小心分离瘢痕组织，较容易显露脊髓损伤区，而且出血也明显减少。显露脊髓损伤区后，再次消毒，逐层缝合肌肉、皮肤。待大鼠清醒后放回动物室单笼饲养。

1.3 评定方法

主要包括手术相关指标评定和大鼠脊髓损伤后的运动功能评价。

1.3.1 手术相关指标评定：为比较2种大鼠脊髓损伤模型建立方法的优缺点，分别从手术操作的难度、术中脊髓定位的准确性和二次显露脊髓损伤区的成功率等方面对2种模型进行评价。具体方法为在制备脊髓损伤模型的手术过程中记录手术持续时间、术中出血量、脊髓后正中线定位难易程度以及术后2周再次显露脊髓损伤区时的手术成功率。

1.3.2 运动学功能评价：脊髓损伤动物模型建立后，还需要进行运动功能学评价，既可以对脊髓损伤模型的稳定性进行评价，也可以对干预因素的效果进行评估。目前常用的运动功能学评价方法有Tarlov法、BBB评分法、步态分析、斜板实验、网格爬行等方法［7⁃8］。每种评价方法均有各自的优缺点，而且根据脊髓损伤的特点有着不同的适用范围。本研究采用了相对敏感且可靠的BBB评分法，分别于术后1 d、3 d、1周和2周对2组大鼠进行运动功能学评分，从而评价2组大鼠后肢运动功能的恢复情况。评分采用双盲法，由经过培训的两人分别独立完成，每只动物的观察时间为4 min。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计分析软件对各组大鼠手术相关参数及运动功能学评分进行统计学分析。结果以x±s表示，2组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 改良脊髓半横断模型在手术操作方面具有优势

首先，改良脊髓半横断模型组大鼠在手术显露时间和出血量方面明显少于常规脊髓半横断模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。可见显露脊髓时，改良脊髓半横断模型组脊髓副损伤的概率较常规脊髓半横断模型组明显降低。

其次，术中脊髓后正中线的定位，改良脊髓半横断模型组较常规脊髓半横断模型组更为简单、准确。常规脊髓半横断模型组半横断脊髓前需将椎板咬除，然后显露脊髓，以脊髓后方的正中血管为标志。然而术中显示大鼠脊髓后正中血管的变异高达40%，因此，常规脊髓半横断模型组需要靠相距较远的T7和T9上下位脊椎的棘突连线以辅助确定脊髓正中线的位置（图1A）。改良脊髓半横断模型组术中将显露脊髓的上位棘突（T8）尖部剪除，保留棘突根部，但并不咬除椎板，切除相邻节段之间的黄韧带即可清晰地看到脊髓后正中血管（图1B），并且可以凭借更近的上下脊椎（T8、T9）棘突连线确定脊髓中部，进行脊髓半切。

表1 常规脊髓半横断模型与改良脊髓半横断模型手术操作相关指标比较Tab.1 Comparison of parameters related with the surgery between standard SCI and improved SCI groups

图1 2组脊髓半横断模型术中脊髓及正中动脉显露照片Fig.1 Photos of the exposed spinal cord and median artery during the surgery in two SCI groups

再次，改良脊髓半横断模型组大鼠在二次显露脊髓损伤区时，明显易于常规脊髓半横断模型组。常规脊髓半横断模型组因在模型制备时咬除了椎板，再次显露脊髓时手术难度加大，并且暴露出的脊髓表面有明显瘢痕粘连形成，且出血明显。常规脊髓半横断模型组8只大鼠因大量出血放弃二次显露脊髓，其中1只大鼠死亡，二次手术成功率仅为20%。改良脊髓半横断模型组在第1次显露脊髓时保留了椎板，有利于二次手术的定位和操作。且二次显露脊髓时，去除椎板后可见脊髓损伤处与周围组织粘连较轻，出血较少（图2），改良脊髓半横断模型组中仅有2只大鼠显露脊髓失败。改良脊髓半横断模型组大鼠二次显露脊髓的成功率明显高于常规脊髓半横断模型组（P＜0.05，表1）。

图2 改良脊髓半横断手术组二次显露脊髓术中照片Fig.2 Photo of the exposed spinal cord during the second sur⁃gery in improved SCI group

2.2 改良脊髓半横断模型大鼠在术后运动功能恢复方面具有优势

常规脊髓半横断模型组和改良脊髓半横断模型组大鼠在脊髓损伤术后3 d内，运动功能均未恢复，BBB运动功能学评分均为零。术后1周时，改良脊髓半横断模型组大鼠BBB评分（3.85±0.46）略高于常规脊髓半横断模型组（3.20±0.42），但差异无统计学意义（P＞0.05）。术后2周时，改良脊髓半横断模型组大鼠BBB运动功能学评分（13.25±1.52）明显高于常规脊髓半横断模型组大鼠（10.45±1.63），差异有统计学意义（P＜0.05）。可见改良脊髓半横断模型组大鼠在术后运动功能恢复方面具有优势。

3 讨论

脊髓损伤研究目前主要在动物体内进行，以期能够模拟人类脊髓损伤时的演变过程，从而实现在动物模型中对脊髓损伤机制和治疗措施进行更有针对性的研究，获得有价值的第一手资料，用于指导临床诊治［9⁃10］。因此，建立理想的动物模型是研究脊髓损伤的基本条件。只有应用与临床疾病相似的实验动物模型，研究的结果才更具有参考意义和科学价值。本研究建立并评价了改良的大鼠脊髓半横断模型，研究发现，改良的脊髓半横断模型相对于常规脊髓半横断模型在手术操作和术后运动功能恢复方面均具有明显的优势，更适于脊髓损伤相关的实验研究。

首先，改良脊髓半横断模型组大鼠损伤恢复更好。常规脊髓半横断大鼠模型具备与临床上脊髓损伤相似的特点，被广泛用作模拟对象进行实验研究［11⁃12］。而改良的脊髓半横断模型是在常规脊髓半横断模型的基础上进行手术细节的调整，对脊髓的损伤标准没有改变。在模型制备术后对其功能变化进行连续观察，并与常规脊髓半横断模型进行对比，二者在脊髓损伤后早期的功能表现上相似，改良脊髓半横断模型组与常规脊髓半横断模型组比较，术后1周内BBB运动功能学评分无明显差异，均具备脊髓半横断损伤的典型表现。从BBB运动功能学评分来看，改良脊髓半横断模型组大鼠损伤恢复的速度较常规脊髓半横断模型组更快一些，而且每只大鼠BBB评分的分布更为集中，这说明改良脊髓半横断模型组大鼠手术副损伤较小，对脊髓非损伤区域干扰小，手术的稳定性更好。

其次，改良脊髓半横断模型的手术操作简单、可重复性、可调控性强。改良脊髓半横断模型组的手术操作因为只需要剪除T8脊椎的棘突尖部，不需要咬除椎板，对脊柱和脊髓周围的血管破坏小，出血量显著减少，同时也减少了止血的操作时间，因此手术时间随之大大缩短。此外，2种方法制备模型手术过程中均联用棘突连线和脊髓后正中血管确定脊髓后正中线，显露脊髓时，改良脊髓半横断模型组不需要咬除椎板，从而降低了手术操作的难度和脊髓副损伤的概率，能更好的保证手术操作的稳定和均衡，更利于研究评价。术中确定脊髓中线时，在脊髓后正中血管变异的时候，需要借助上下位棘突水平确定。常规脊髓半横断模型由于已经咬除椎板，脊柱稳定性减弱，上下位棘突距离又较远，定位容易受到一定的影响。但是在改良脊髓半横断模型中，可以通过相邻、更近的棘突连线确定脊髓中线，能够更准确地定位脊髓后正中线，利于准确实施脊髓半横断损伤的操作。因而，改良脊髓半横断模型还具有操作简单、可重复性和可调控性强等优势。

再次，改良脊髓半横断模型的死亡率低，并发症少。改良的脊髓半横断模型因手术时间缩短，术中出血量明显减少，这样可以降低对动物的打击，使其能够更快的恢复。这种优势在仅进行脊髓半横断损伤时表现的还不明显，但是对于需要二次显露脊髓的手术，改良手术的优势就充分体现出来。改良的手术方法并没有去除椎板，隔断了脊髓瘢痕组织与周围其他软组织的粘连，使得再次显露脊髓更为容易。且二次手术术中不需要剥离过多的软组织瘢痕，自然就减少了术中出血量，可更大限度地允许手术的实施，也能更加保证大鼠的术后成活率。同时因为改良脊髓半横断模型组的脊髓瘢痕组织很少与周围软组织粘连，更容易观察脊髓损伤区的位置，这样更有利于给予治疗干预措施。

总之，改良的脊髓半横断模型，无论是在手术时间、术中出血量及术中脊髓中线定位，还是在术后运动功能学评分，尤其是二次显露脊髓方面，均显示出明显的优势。该模型更加适用于脊髓损伤的研究，尤其适用于非急性期脊髓损伤的治疗研究。

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（编辑 陈 姜）

Establishment and Evaluation of Improved Hemisection Model of Spinal Cord Injury in Rats

SUN Deri1，HU Huiyuan2，ZHU Yue3
（1.Department of Orthopedics，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China；2.Department of Pharmaceutical Toxicology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China；3.Department of Orthopedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To establish an improved hemisection model of spinal cord injury（SCI）in rats with less severe injury and increased sur⁃vival rate.Methods Female Sprague⁃Dawley rats（n=20）were randomly divided into 2 groups：standard and improved hemisection model of SCI.Basso⁃Beattie⁃Bresnahan（BBB）scores were carried out to determine the hindlimb locomotor function at 1 d，3 d，1 week and 2 weeks post SCI，respectively.In addition，duration of operation，blood loss，location of posterior midline，and success rate of spinal cord exposure during the second surgery were used as the main parameters to evaluate the significance of the new model.Results Compared with the standard hemisection model，the improved hemisection model of SCI exhibited shorter duration of operation，less blood loss，higher BBB score，more accurate location of posterior midline，and higher success rate of spinal cord exposure during the second surgery.Based on the improved hemisection model of SCI，transplantation model of scar tissue in spine cord was then successfully constructed with a success rate above 70%.Conclusion The improved hemisection model of SCI shows significant advantages in many aspects related to the operation，which is applicable to the study of SCI，especially the non⁃acute SCI.

spinal cord injury；rat models；modification

R683.2

A

0258-4646（2017）03-0223-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.03.008

辽宁省自然科学基金（2013021032）

孙德日（1978-），男，主治医师，硕士.

朱悦，E-mail：Zhuyuedr@163.com

2016-11-11

网络出版时间：