鼻腔鼻窦鳞状细胞癌细胞中PRL-3表达的临床意义*

陆鸿略，马桂琴，岳卓立△，康 菲

(承德医学院附属医院：1.耳鼻咽喉科；2.体检科，河北承德 067000)

鼻腔鼻窦鳞状细胞癌细胞中PRL-3表达的临床意义*

陆鸿略1，马桂琴1，岳卓立1△，康 菲2

(承德医学院附属医院：1.耳鼻咽喉科；2.体检科，河北承德 067000)

目的 探讨促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)在鼻腔鼻窦鳞状细胞癌(SNSCC)中表达的临床意义。方法 采用免疫组织化学及逆转录PCR(RT-PCR)方法检测62例SNSCC组织(SNSCC组)中PRL-3蛋白的表达水平，并对30例鼻息肉患者(NP组)，以及25例正常鼻腔黏膜(对照组)做相同蛋白表达并进行对比。结果 在蛋白水平和基因水平检测，均发现SNSCC组中PRL-3的表达高于NP组及对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。PRL-3的表达情况在不同的性别、年龄中差异无统计学意义(P>0.05)，而随着TNM分期的增高，分化程度的降低及合并淋巴结转移，PRL-3的表达明显增高(P<0.05)。结论PRL-3的表达可以对SNSCC的增殖活性作很好的参照，表达强度可明显反映SNSCC细胞增殖活性，PRL-3可能是SNSCC的一个独立预后指标，提示预后不良。

鼻腔；鼻窦；癌，鳞状细胞；促肝细胞再生磷酸酶-3

促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)属于酪氨酸蛋白磷酸酶，它是目前发现的与恶性肿瘤细胞的转移相关的一个重要基因，它可以促进恶性肿瘤细胞的增殖黏附及迁移[1]。目前，鲜见PRL-3在鼻腔鼻窦鳞状细胞癌(SNSCC)中的表达及意义的报道，其与SNSCC的生长、浸润和转移关系尚待研究。本研究就采用免疫组织化学及逆转录PCR(RT-PCR)的方法检测PRL-3在SNSCC中的表达情况，分析PRL-3与SNSCC临床病理特征的关系，探讨PRL-3与SNSCC分化、转移及预后之间的关系，为临床早期诊断SNSCC提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本院2007年12月至2014年12月手术切除或活检的62例SNSCC组织(SNSCC组)，30例鼻息肉(NP组)和25例接受中鼻甲部分切除术患者的切除中鼻甲黏膜组织(对照组)。其中，SNSCC组男39例，女23例，年龄32～77岁；NP组男19例，女11例，年龄16～70岁；对照组男13例，女12例，年龄18～53岁。SNSCC组均未接受任何的放化疗或免疫治疗。所有标本取材后平分为两份，一份送病理科做成石蜡块，另一份放入液氮中冰冻保存。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 鼠抗人PRL-3单克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司；羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)/辣根酶标记二抗和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Trizol、逆转录试剂盒购自Takara公司；PCR引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司；50 bp DNA Ladder购自北京天根生化有限公司。

1.2.2 免疫组织化学(SP法)检测PRL-3的表达 取包埋石蜡块、4 μm连续切片。按SP法试剂盒操作规程说明书进行免疫组织化学染色，切片常规脱蜡、水化，进行抗原修复，经DAB显色，苏木素复染后，脱水、封片。用已知阳性标本阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照。结果判定：PRL-3阳性表达为在细胞膜及膜周细胞质中出现棕黄色颗粒，每张切片取5～8个高倍视野进行观察，每个视野的细胞计数为100个，取平均数，根据阳性细胞百分比来对PRL-3阳性细胞数进行判断，≤25%为(-)，>25%～<51%为(+)，51%～75%为(++)，>75%为(+++)。

1.2.3 RT-PCR法检测PRL-3的表达 冻存的SNSCC标本按Trizol一步法，提取总RNA，将2 μg 总RNA为模板逆转录为cDNA，以cDNA产物为模板，PRL-3和GAPDH为引物，行PCR扩增。根据已知PRL-3基因序列，上游引物序列：5′-GGG ACT TCT CAG GTC GTG TC-3′,下游引物序列5′-AGC CCC GTA CTT CTT CAG GT-3′。β-actin上游引物序列5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3′,下游引物序列5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′。严格按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作，荧光定量PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环。72 ℃终延伸10 min，取PCR产物行质量分数1%琼脂糖凝胶电泳分析，经溴化乙锭显影后，凝胶成像系统成像，并进行光密度半定量分析。目的基因的相对表达量以目的条带积分光密度(OD)值与内参照条带OD值的比值表示。

2 结 果

2.1PRL-3蛋白在3组患者标本组织中的表达情况PRL-3蛋白在SNSCC组(75.81%)中的表达显著高于在对照组(20.00%)及NP组(40.00%)中的表达，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

表1 PRL-3蛋白在3组组织中的表达情况[n(%)]

a：P<0.05，与SNSCC组比较。

A：对照组；B：NP组；C：SNSCC组。

图1PRL-3蛋白在3组组织标本中的表达情况(SP，×200)

2.2PRL-3蛋白在SNSCC组织中的表达与临床病理特征的关系PRL-3蛋白在SNSCC中的表达与病理分期、分化程度及合并淋巴结转移有关(P<0.05)，与性别、年龄无关(P>0.05)，见表2。

表2 PRL-3蛋白在SNSCC组织中的表达与临床病理特征的关系[n(%)]

续表2 PRL-3蛋白在SNSCC组织中的表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.3RT-PCR法检测PRL-3蛋白在3组组织中的表达SNSCC组中的PRL-3mRNA相对表达量(0.89±0.09)明显高于NP组(0.57±0.06)及对照组(0.21±0.02)(P<0.05)。RT-PCR反应后电泳结果见图2。

M：100bpDNAMarker；1.对照组；2.NP组；3.SNSCC组。

图2RT-PCR检测PRL-3蛋白在3组组织中的表达

3 讨 论

PRLs属于一类酪氨酸蛋白磷酸酶，其家族包含3个亚型，即PRL-1、PRL-2和PRL-3。而其中以PRL-3在肿瘤中的生物活性最显著。PRL-3位于染色体8q24.3上，含有PTP催化位点序列，其编码蛋白产物含有一个保守的C-末端半胱氨酸CAAX残基-异戊烯化结构域[2]，此结构域内的Cys104和Arg110保守催化残基与PRL-3的酶活性有关。PRL-3蛋白在人的骨骼肌、胰腺组织及心肌细胞中有不同程度的表达，而脑肺肝肾等组织鲜有表达[3]。它具有促进细胞生长和增殖，增强恶性细胞迁移和浸润能力，还有促进细胞恶化及转移等多种功能[4-7]，具体作用机制包括以下几点：(1)PRL-3可通过激活Rho信号转导途径，调控肿瘤细胞的侵袭和活动性，促进肿瘤细胞的增殖及转移[8-9]；(2)PRL-3可通过介导ERK信号传导通路，促进肿瘤血管的生成，从而促进肿瘤的生长及成熟，促进淋巴结转移及远处转移[10-11]；(3)PRL-3可通过诱导促进血管内皮生长因子(VEGF)及其受体的过度表达，促进肿瘤的生长、侵袭及转移[6,12]；(4)PRL-3还可通过调节其他癌症相关基因的表达来介导肿瘤的侵袭、转移[13]；(5)PRL-3通过正调控PI3K细胞通路，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞分裂增殖，诱导肿瘤细胞生长。此外，PRL-3还可通过调节PI3K通路促进肿瘤的侵袭及转移[14]；(6)PRL-3可促进转移性肿瘤的形成[15]。本研究显示，SNSCC组织中的PRL-3的表达明显高于NP组织及正常鼻腔黏膜组织，而且与SNSCC的TNM分期、分化程度及淋巴结转移密切相关。此结果提示在SNSCC的发生、发展及转移过程中PRL-3可能发挥了重要的作用。因此，检测PRL-3可能对早期发现SNSCC具有重要的临床意义，同时，对SNSCC生物学行为、预后具有重要意义，有可能成为SNSCC治疗的靶点及预后标记物。

本研究对PRL-3高表达与SNSCC的发生、发展及转移的关系在分子水平上提供了一些理论基础，但其具体作用机制，尤其是PRL-3通过何途径促进SNSCC转移的，仍需进一步探讨。

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Clinical significance of PRL-3 expression in sinonasal squamous cell cancer cells*

LuHonglue1，MaGuiqin1，YueZhuoli1△，KangFei2

(1.DepartmentofOtolaryngology；2.DepartmentofPhysicalExamination,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde，Hebei067000，China)

Objective To investigate the clinical significance of PRL-3 expression in sinonasal squamous cell cancer(SNSCC).Methods The immunohistochemical method and RT-PCR were adopted to detect the PRL-3 protein expression level in 62 cases of SNSCC tissue (SNSCC group),30 cases of nasal polyps(NP group) tissue and 25 cases of normal nasal mucosa tissue(control group).The obtained results were compared.Results Both in the protein level and gene level detection，the expression of PRL-3 in the SNSCC group was higher than that in the NP group and control group,the difference was statistically significant (P<0.05).The expression of PRL-3 had no significant differences among different ages and between different genders(P>0.05)，but with TNM stage increasing,differentiation degree decreasing and complicating lymph node metastasis,the expression of PRL-3 was significantly increased(P<0.05).Conclusion The PRL-3 expression can serve as good reference for the proliferation activity of SNSCC,its expressing intensity can obviously reflect the SNSCC cell proliferation activity,PRL-3 probably is an independent prognostic index of SNSCC，indicating poor prognosis.

nasal cavity;paranasal sinus;carcinoma，squamous cell;regenerative liver phosphatase-3

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.01.019

承德市科学技术研究与发展计划项目(201601A047)。

陆鸿略(1978-)，主治医师，硕士，主要从事鼻部疾病的诊断与治疗方面研究。△

E-mail：yuezhuoli@163.com。

R

A

1671-8348(2017)01-0081-03

2016-07-20

2016-09-12)