6,7，4′-三羟基异黄酮(T2)水溶性衍生物的合成及其对宫颈癌细胞抑制作用的研究*

袁少隆,李 蓉

(第三军医大学军事预防医学院防原医学教研室/全军复合伤研究所/创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400030)

6,7，4′-三羟基异黄酮(T2)水溶性衍生物的合成及其对宫颈癌细胞抑制作用的研究*

袁少隆,李 蓉△

(第三军医大学军事预防医学院防原医学教研室/全军复合伤研究所/创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400030)

目的 合成6,7,4′-三羟基异黄酮(6,7,4′-trihydroxyisoflavone，T2)水溶性衍生物，对其结构进行表征，并对其抗肿瘤活性进行评价。方法 通过磺化反应在原料B环中3＇位引入磺酸基(-SO3H)，进一步浓氨水氨化后得到水溶性显著提高的异黄酮衍生物，通过氢谱、碳谱、质谱、元素分析等对其结构进行表征，CCK-8法及流式测定其杀伤宫颈癌细胞(Hela)的活性。结果 通过上述方法得到两种水溶性异黄酮衍生物T2-SO3H·2H2O和T2-SO3(NH4)2，产率分别为：96%、75%，生物试验显示其中T2-SO3(NH4)2抗肿瘤活性显著增强。结论 与T2相比，其水溶性衍生物具有更高的生物相容性及抗肿瘤活性，有广泛的生物应用前景。

异黄酮类；宫颈肿瘤；异黄酮衍生物；水溶性；磺化反应；抗肿瘤

宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，故对宫颈癌治疗的研究已成为国内外学者研究的重点[1]。研究表明，大豆异黄酮(isoflavone，SI) 及其衍生物可明显抑制宫颈癌细胞的增殖，其机制多为诱导胞内信号分子改变，细胞周期阻滞及促进凋亡相关基因的表达[2-3]。然而，异黄酮及其衍生物存在水溶性及脂溶性差的弊端，体内难以吸收，生物利用度低，限制了其生物应用。鉴于此，在前期合成的6,7,4′-三羟基异黄酮(6,7,4′- trihydroxyisoflavone，T2)的基础上[4]，化学合成了其水溶性衍生物T2-SO3(NH4)2，并研究了其对宫颈癌细胞生长的抑制作用，以期寻找到一种新型的抗宫颈癌药物。

1 材料与方法

1.1 材料 T2来自于本实验室前期合成(生产批号：20140625)。人宫颈癌细胞Hela 购自中国科学院细胞库，细胞在常规条件下培养，取对数生长期的细胞用于试验。

1.2 试剂与仪器 DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰酶购于美国Gibco公司，批号分别为20150706、20150524、20150612；细胞增殖活性测定试剂盒(CCK-8)购于日本Dojindo有限公司，批号20150815；细胞凋亡检测试剂盒(FITC标记了的膜联蛋白-V/碘化丙啶，Annexin V-FITC/PI)购于美国Bipec Biopharma公司；浓硫酸，浓氨水购于中国科龙试剂公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；多功能全自动酶标仪购于美国Molecular Devices公司；流式细胞仪购于美国BD公司；高速离心机购于中国湖南湘仪公司；磁力搅拌器购于德国IKA公司；隔膜泵购于日本东京理化公司；真空干燥箱购于中国上海一恒公司。

1.3 方法

1.3.1 3＇-磺酸基-6,7,4＇-三羟基异黄酮(3′-sulfonic-6,7,4′-Trihydroxyisoflavone,T2-SO3H·2H2O)的合成及表征 T2由本课题组前期合成[5]。取5.0 g T2于100 mL圆底烧瓶中，分别加入10、15、20、25、30或35 mL浓硫酸。超声振荡使原料溶解后，分别搅拌4、8、12、16或20 h，搅拌温度分别为5、15、25、35、45、55 ℃。薄层色谱分析(thin layer chromatography，TLC)检测反应进程，反应结束后，将反应液滴加到0 ℃的水中，控温搅拌反应30 min，于沙芯漏斗中抽滤反应液。取50 mL乙腈搅洗得到的固体至中性，烘干。对得到的化合物进行熔点(mp)、氢核磁共振(1H NMR，400 MH，溶剂为DMSO)、高分辨质谱(ESI MS，水溶液)及碳核磁共振 (13C NMR，50MHz，溶剂为DMSO)分析测试。

1.3.2 3＇-磺酸氨-4＇-羟氨-6,7-二羟基异黄酮[ (3′-sulfoacid-4′-hydroxylamine-6,7,4′-Trihydroxyisoflavone,T2-SO3(NH4)2)]的合成及表征 取5.0 g T2-SO3H·2H2O置于50 mL圆底烧瓶中，加入30 mL浓氨水，避光磁力强烈搅拌反应24 h后，向其中加入50 mL丙酮溶液后，布氏漏斗过滤，用丙酮洗涤至中性，去掉多余的氨水溶液。最后将产品置于真空干燥箱烘干。对得到的产品进行ESI MS(水溶液)、元素含量分析、1H NMR(400 MH，溶剂为DMSO)及13C NMR(50 MHz，溶剂为DMSO)分析测试。

1.3.3 水溶性比较 分别取T2、T2-SO3H·2H2O、T2-SO3(NH4)2各0.2 g置于烧杯中，加水至刚好溶解澄清，观察各化合物溶解度情况，并对各化合物水溶液的体系pH值进行测定。

1.3.4 细胞增殖研究 将Hela细胞按2 000/孔接种于96孔板，每孔100 μL。37 ℃， 5%CO2增湿培养箱中孵育24 h后，各组细胞分别加入浓度为0、0.1、1.0、10.0、20.0 μmol/L的T2或T2-SO3(NH4)2，每组3个复孔，继续孵育48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃避光孵育2 h，多功能酶标仪测定450 nm处各孔吸光度(A)值，计算细胞增殖活性。

1.3.5 流式细胞技术检测细胞凋亡 Hela细胞按1×105/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔1 mL，孵育箱内培养24 h。各组细胞分别加入浓度为0、1.0、10.0、20.0 μmol/L的T2或T2-SO3(NH4)2处理，继续孵育48 h。胰酶消化法收集细胞，1 500 r/min离心5 min，弃去培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。采用细胞凋亡检测试剂盒测定细胞凋亡率，将细胞与Annexin V-FITC/PI室温避光共孵育15 min，上流式细胞仪进行检测。

2 结 果

2.1 T2-SO3H·2H2O的合成及表征 首先通过T2与浓硫酸的磺化反应，对异黄酮骨架的芳环进行选择性活化，合成反应路线及机理如图1，最终生成化合物T2-SO3H·2H2O。本研究探讨了浓硫酸用量、磺化反应温度及反应时间对T2-SO3H·2H2O产率的影响。当T2投料量为5.0 g时，其反应产率随着浓硫酸用量、反应温度及反应时间的增加，呈现先升后降的趋势(图2)。浓硫酸用量为25 mL，反应温度在25 ℃，反应时间控制在12 h时产率最大(分别为88.2%、89.3%、84.6%)，反应结果较理想。使用优化后的反应条件，T2投料5.0 g，得到T2-SO3H·2H2O共7.2 g，计算其产率96.0%。随后对得到的T2-SO3H·2H2O进行化学表征。mp测试结果大于300 ℃。1H NMR测试结果显示氢原子出峰(包括相应裂峰)位置δppm分别为8.268(1H,s,H-2)，7.690(1H,s,H-5)，7.370(2H,d,J=8.6Hz，H-2，H-6′)，6.912(1H,s,H-8)，6.820(1H,s,H-5′)。 ESI MS分析结果显示主要离子峰为349(M-1)-。13C NMR分析结果显示碳原子出峰位置δppm分别为174.345、152.975、152.727、152.209、150.947、144.614、131.555、130.469、127.707、122.825、122.284、116.610、116.214、108.131、102.823。

A：T2-SO3(NH4)2合成示意图；B：芳环选择活化的机理。

图1 T2-SO3(NH4)2合成反应路线及机理

A：浓硫酸用量；B：反应温度；C：反应时间；D：20 mg/mL T2，T2-SO3H·2H2O,T2-SO3(NH4)2的水溶液照片。

图2 T2磺化反应条件试验

2.2 T2-SO3(NH4)2的合成及表征 进一步通过T2-SO3H·2H2O与浓氨水的氨化反应生成T2-SO3(NH4)2，其合成路线如图1A。T2-SO3H·2H2O投料5.0 g，得到T2-SO3(NH4)2共3.8 g，计算其产率75.00%。ESI MS分析结果显示主要离子峰为349(M-2NH4)+,进一步的元素含量分析显示其碳元素含量为45.80%，氮元素含量为7.33%，氢元素含量为4.41%，其1H NMR及13C NMR结果见图3。

A：T2-SO3(NH4)2的1H NMR；B：T2-SO3(NH4)2的13C NMR。

图3 T2-SO3(NH4)2的结构表征分析

2.3 水溶性比较 对T2、T2-SO3H·2H2O及T2-SO3(NH4)2的水溶性进行考察，20 mg/mL T2，T2-SO3H·2H2O及 T2-SO3(NH4)2的水溶液照片如图2D，T2-SO3H·2H2O及

表1 T2及其衍生物在水中溶解度测试结果比较

T2-SO3(NH4)2均为橙色澄清水溶液，T2为乳白色混悬液。3种化合物具体溶解度如表1，相比T2(溶解度：<0.1 mg/mL)，T2-SO3H·2H2O(溶解度：50.0 mg/mL)和T2-SO3(NH4)2(溶解度：1 000.0 mg/mL) 的水溶性明显提高，尤其是T2-SO3(NH4)2达到了易溶的范围。对各化合物溶解后的体系pH测定显示，T2(pH：6～7)及T2-SO3(NH4)2(pH：7～8)的pH均在生理pH范围内，而T2-SO3H·2H2O溶解后呈强酸性环境(pH：2～4)。

2.4 抗肿瘤活性研究 研究T2水溶性改造对其抗肿瘤活性的影响，如图4A所示，随着浓度的增大，T2及T2-SO3(NH4)2对Hela细胞增殖抑制呈现浓度依赖式增加，20 μmol/L时细胞存活率仅40.0%～50.0%；而在浓度大于1 μmol/L时，T2-SO3(NH4)2对Hela细胞的损伤显著强于T2(细胞存活率降低约5.1%～9.3%)。细胞凋亡分析如图4B，随着浓度的增大，T2及T2-SO3(NH4)2处理Hela细胞凋亡率呈现浓度依赖式增加，T2-SO3(NH4)2诱导Hela细胞总凋亡率显著高于T2 (细胞总凋亡率增加3.08%～12.17%)。

A：T2及T2-SO3(NH4)2对Hela细胞增殖活性影响，*P<0.05，与相同浓度T2组比较；B：T2及T2-SO3(NH4)2对Hela细胞凋亡的影响。

图4 T2及T2-SO3(NH4)2抗肿瘤活性比较

3 讨 论

三羟基异黄酮因其独特的化学结构，对宫颈癌细胞的抑制作用最佳。但由于其水溶性差，难以做成注射剂，水溶性和脂溶性差,做成片剂在体内也难以吸收，生物利用度不高，严重阻碍了其抑癌作用的新型药物的开发。因此，对其进行水溶性修饰改造，是有必要的。

T2与浓硫酸的磺化反应属于亲电子取代反应，反应中浓硫酸既是磺化剂又是溶剂。异黄酮骨架的B芳环活化，而A芳环却未被磺化。其机制为在磺化反应过程中，浓硫酸提供的质子可以与异黄酮骨架吡喃环(C环)的氧原子结合生成佯盐。C环氧原子的质子化使氧原子带部分正电荷，同时对A环产生吸电子效应，使A环被钝化，不发生磺化反应。从而高选择性地在原料B环中3＇位引入磺酸基，该基团易被高浓度氨水氨化[5]，从而得到异黄酮衍生物T2-SO3(NH4)2。通过相应的ESI MS、元素含量分析、结构表征分析、1H NMR及13C NMR结果分析研究，从而确证T2的水溶性衍生物，即T2-SO3H·2H2O及T2-SO3(NH4)2的分子结构，为进一步探索其的水溶性和生物学活性奠定了基础。由于磺酸水溶性很好，因此T2 B环中引入磺酸基能显著提高化合物的水溶性。但由于磺酸基具有强酸性，因此T2-SO3H·2H2O溶解后pH较低，不适于生理pH环境。而氨基的引入，可以中和磺酸基的强酸性，因此T2-SO3(NH4)2兼具较高的水溶性及生物相容性，因此具有更广的生物应用前景。

大量研究证实，异黄酮及其衍生物通过诱导凋亡相关基因如抑癌基因p53及B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，BCL-2)的表达[6-7]，调节细胞增殖与分化相关信号如ERK1/2和MAPK通路[8-9]，改变细胞周期相关蛋白如CDKs蛋白激酶、细胞周期蛋白cyclin A/B的表达[10-12]，从而诱导肿瘤细胞凋亡，延长细胞周期阻滞时间，抑制肿瘤细胞增殖。本研究也证实了较低浓度的T2对能诱导宫颈癌细胞发生凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖。而其水溶性衍生物T2-SO3(NH4)2的抗肿瘤活性显著增强，其机制可能与T2-SO3(NH4)2水溶性的改善，相同浓度进入细胞的有效成分有所增加，因此细胞的生物利用度也相应提高有关。而化合物中-SO3(NH4)2对细胞活性是否存在影响，还需进一步研究。

综上所述，本研究在T2的基础上，创新性地引入磺酸氨基团，改善了化合物的水溶性，提高了抗宫颈癌细胞增殖的效应。对后期进一步机制研究及异黄酮抗癌新药的开发奠定了基础，具有重要的生物应用前景。

[1]王临虹，邱琇，郑睿敏，等．我国宫颈癌流行病学状况及防治策略的回顾与展望[J]．中国妇幼卫生杂志，2010，1(3)：146-149．

[2]蒋葭蒹，冉昇，吴婷婷，等．大豆异黄酮及其衍生物对宫颈癌细胞增殖的影响[J]．大豆科学，2012，31(6)：1017-1020,1023．

[3]韩小龙，王培玉，李子一，等．金雀异黄素对宫颈癌细胞增殖的影响[J]．北京大学学报(医学版)，2015，47(3)：551-554．

[4]Liu J,Yang ZY,Luo SL,et al.Facile method for the large-scale synthesis of 6,7,4′- trihydroxyisoflavone[J].Synthetic Commun,2014(44):3296-3303.

[5]Zhang CP,Ni H,Tu HY,et al.Genistein-3′-sulfonic acid dehydrate[J].Acta Crystallogr Sect E Struct Rep Online,2009(65):1137-1138.

[6]张淑华．大豆苷元对宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响和机制[D]．扬州：扬州大学，2011．

[7]ChenZP,YeungDC.Regulationofp53expressioninHeLacells[J].BiochemMolBiolInt,1996,38(3):607-616.

[8]YatagaiC,SinguT,MaruyamaM,etal.GenisteinanditsanalogueenhancedtissueplasminogenactivatoractivityinHeLaS3[J].PathophysiolHaemostThromb,2007,36(6):298-304.

[9]KimSH,KimSH,KimYB,etal.Genisteininhibitscellgrowthbymodulatingvariousmitogen-activatedproteinkinasesandAKTincervicalcancercells[J].AnnNYAcadSci,2009(1171):495-500.

[10]LeeDE,LeeKW,JungSK,etal.6,7,4′-trihydroxyisoflavoneinhibitsHCT-116humancoloncancercellproliferationbytargetingCDK1andCDK2[J].Carcinogenesis,2011,32(4):629-635.

[11]YasharCM,SpanosWJ,TaylorDD,etal.Potentiationoftheradiationeffectwithgenisteinincervicalcancercells[J].GynecolOncol,2005,99(1):199-205.

[12]GuoJM,KangGZ,XiaoBX,etal.Effectofdaidzeinoncellgrowth,cellcycle,andtelomeraseactivityofhumancervicalcancerinvitro[J].IntJGynecolCancer,2004,14(5):882-888.

Synthesize of water-solubility derivant of 6,7,4′- trihydroxyisoflavone (T2) and study of its inhibition effect on human breast cancer cell proliferation*

YuanShaolong,LiRong△

(TeachingandResearchingSectionofProtectiveMedicineagainstNuclearWeapons,InstituteofCombinedInjury/StateKeyLaboratoryofTrauma/BurnsandCombinedInjury,CollegeofPreventiveMedicine,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400030,China)

Objective To synthesize of water-solubility derivant of 6,7,4′- trihydroxyisoflavone(T2),to characterize its structure and to evaluate its anti-tumor activity.Methods The sulfonic group(-SO3H) was grafted to 3＇position in loop B of T2 through sulfonation reaction,then strong aqua was added to above production,and obtained a water-solubility elevated compound named T2-SO3(NH4)2through ammoniation.The construction of T2-SO3(NH4)2was characterized by1H-NMR,13C NMR,MS and element analysis.Its activity for killing human breast cancer cells (Hela) was analyzed by CCK-8 assay and flow cytometry.Results The two kinds of water-solubility derivant of T2-SO3H·2H2O and T2-SO3(NH4)2were obtained through above methods,and their yield rates were 96% and 75% respectively.The biological experiments showed that the anti-tumor activity of T2-SO3(NH4)2was significantly enhanced.Conclusion Compared to T2,T2-SO3(NH4)2exhibit higher biocompatibility and anti-tumor activity with vast biological application prospect.

isoflavones;uterine cervical neoplasms;derivant of trihydroxyisoflavone;water-solubility;sulfonation reaction;anti-tumor

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.01.005

国家自然科学基金资助项目(81172601)。

袁少隆(1983-)，技师，本科，主要从事肿瘤化疗相关临床与基础方面研究。△

E-mail:lrong361@126.com。

R

A

1671-8348(2017)01-0033-03

2016-07-15

2016-08-18)