止痢草油对公猪精子形态、精子膜及抗氧化作用的影响

刘 庆，段润甲，周远飞，魏宏逵，彭 健,2

（1. 华中农业大学动物科技学院动物营养与饲料科学系，湖北武汉 430070；2. 生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070）

止痢草油对公猪精子形态、精子膜及抗氧化作用的影响

刘 庆1，段润甲1，周远飞1，魏宏逵1，彭 健1,2*

（1. 华中农业大学动物科技学院动物营养与饲料科学系，湖北武汉 430070；2. 生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070）

试验旨在研究鱼油饲粮中止痢草油添加量对公猪精子形态、精子膜及抗氧化作用的影响。选用34头健康成熟公猪，随机分为4组，分别饲喂添加100 mg/kg维生素E（1组，n=8）和250（2组，n=8）、500（3组，n=9）、750 mg/kg（4组，n=9）的止痢草油饲粮，试验期16周。结果表明：在整个试验期，试验3组的精子远端原生质滴比例低于1组（P＜0.05），试验3组在16周的精子正常形态分别较试验1和4组有极显著提高（P＜0.01）；在整个试验期，试验2、3和4组精清超氧化物歧化酶活性均高于1组（P＜0.05）；试验2和3组膜结构完整性在12周较4组有显著提高，而试验3组膜结构完整性和线粒体膜电位在16周较1和4组有显著提高（P＜0.05）。结果提示，鱼油饲粮添加止痢草油可增强公猪血清和精清抗氧化能力，添加500 mg/kg止痢草油有利于精子膜的改善，从而改善了精子形态。

公猪；止痢草油；精子形态；精子膜；抗氧化

人工授精技术的发展使公猪在养猪生产中的作用愈加重要，而低品质精液是母猪人工授精成功的限制因素之一。其中，公猪精子形态是精子受精能力的关键指标，如精子畸形率与母猪受胎率呈负相关[1]。研究表明，鱼油饲粮有利于公猪精液品质的改善[2]。然而鱼油日粮富含的多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFA）会增加精子脂质过氧化敏感性[3]，损伤精子膜完整性，不利于精子形态和受精能力[3-4]。日粮抗氧化剂（如维生素E）常用来缓解这种脂质过氧化。本试验室前期研究发现，400 mg/kg维生素E较200 mg/kg维生素E降低了精子脂质过氧化，改善了精子活力[5]。Strzezek等[2]报道，鱼油饲粮添加抗氧化剂可改善9～16周公猪精子抗氧化酶活性。因此，进一步延长试验周期可能提高抗氧化状态并改善精子形态。止痢草油（Oregano Essential Oil，OEO）是天然的植物提取物，富含香芹酚和百里香酚，具有与维生素E效果相当的抗氧化能力。母猪饲粮添加OEO可缓解机体氧化应激水平，并改善母猪繁殖性能[6]。目前还未见OEO对公猪繁殖性能的影响。为阻止鱼油饲粮可能引起的睾丸组织及精子的过氧化损伤，添加抗氧化能力与维生素E相当的OEO，研究其对公猪血清和精清抗氧化状态的调节，从而为OEO缓解氧化应激对精子膜功能及精子形态的氧化损伤提供依据和支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 大豆油选用山东渤海实业股份有限公司生产的饲料级豆油（含51.8%亚油酸，C18:2n-6）；鱼油为山东荣成爱尔斯海洋生物科技有限公司提供（含25% C22:6n-3和10% C20:5n-3）；维生素E选用浙江新和成股份有限公司生产的DL-α-生育酚醋酸酯（纯度50%）；止痢草油为广州美瑞泰科生物工程技术有限公司生产提供（商品名为Phytogen，主要活性成分为香芹酚2.75%，百里香酚0.075%）。

1.2 试验设计及饲粮 试验选取34头年龄（544±51.4d）和体重（264±7.9 kg）接近的杜洛克公猪（选自广西扬翔股份有限公司猪基因分公司武鸣公猪站）开展动物饲养试验。试验公猪每日摄入2.5 kg基础饲粮（见表1），45 g豆油和15 g鱼油（为实现公猪日粮n-6:n-3比为6.6:1）。本试验饲喂的鱼油日粮基于前期试验结果，即为满足公猪精子n-3 PUFA的需要[8]。所有的试验饲粮参照NRC[7]满足或超过公猪营养需要配制为等能等氮饲粮。本试验不以研究日粮n-3 PUFA对公猪精液品质的影响为目的，因此未饲喂公猪不添加鱼油的日粮。试验公猪按照年龄和体重相近原则随机分为4组，分别饲喂添加100 mg/kg维生素E（1组，n=8）和250（2组，n=8）、500（3组，n=9）、750 mg/kg（4组，n=9）的OEO饲粮。试验期16周。

表1 基础饲粮和营养成分（饲喂基础）

1.3 饲养管理 饲养试验在广西扬翔股份有限公司猪基因分公司武鸣公猪站进行。按猪场正常程序免疫和驱虫、清洁和消毒，保持圈舍通风、卫生和干燥。试验公猪单栏饲养，每天饲喂2次，分别在08:00和17:00饲喂，自由饮水。本试验0周（正式试验前1周）到10周舍内温度平均（28±2）℃，每头公猪每日供给2.5 kg饲料；第11周到第16周进入冬季，舍内温度为（17±2）℃，每头公猪每日供给3 kg饲料。试验期内每两周由同一操作熟练的技术人员采精3次。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 样品采集 试验期第0、8、12、16周，公猪行前腔静脉采血10 mL，取血清于-20℃保存，用于超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）含量的测定。每次采集精液后，取10 mL新鲜精液于离心管中，在1 800×g离心分离15 min，吸取精清并分装于-20℃保存，用于SOD、GSH-Px和MDA含量的测定；另一份精液经常温稀释剂稀释后用于精子形态和精子膜结构和功能的检测。其中，精子膜结构和功能的检测是在24 h内17℃保存条件下送往广西大学试验室完成[4]。

1.4.2 公猪精子形态的测定 新鲜精液稀释后，参照试验室测定精子形态的方法[5]，即采用伊红染色法测定精子形态。在400倍显微镜下观察记录200个精子后，分别对正常精子形态、畸形头部和尾部、近端和远端原生质滴、断头和卷尾精子计数，计算其与总精子数的比例。重复测定2次，计算其平均值。

1.4.3 血清和精清中抗氧化酶活和丙二醛的测定血清和精清中的SOD酶活、GSH-Px酶活和丙二醛（MDA）含量分别采用邻苯三酚自氧化法、5′5-双硫代对硝基苯甲酸比色法和硫代巴比妥酸比色法在酶标仪上用南京建成生物有限公司提供的相应试剂盒测定。试验步骤严格按说明书指导执行。

1.4.4 精子膜结构和功能的测定 精子膜结构完整性、精子膜功能完整性和精子膜流动性分别采用伊红染色法，低渗膨胀法和荧光偏振法测定，线粒体膜电位（MMP）采用流式细胞法测定[4]。

1.5 统计分析 精子形态、血清和精清中抗氧化指标及精子膜结构和功能用SAS 8.1统计软件分析。首先对数据进行正态分布检验（显著水平P＜0.05）。对于不符合正态分布的数据，通过sqrt（x）、arsin[sqrt（x/100）]、log10（x）数据转换适合后，采用有重复方差分析和多重比较，结果以平均值±混合标准误表示，以P＜0.05为显著标准，P＜0.01为极显著标准。

2 结 果

2.1 精子形态 由表2可知，在整个试验期，各组公猪的精子远端原生质滴比例差异显著，试验3组显著低于1组（P＜0.05）。添加OEO具有降低精子畸形尾部比例和断头比例的趋势（P=0.11），即整个试验期畸形尾部比例为试验3组＜2组＜4组＜1组；断头比例为试验3组＜1组＜4组＜2组。试验第16周各组公猪的精子正常形态差异显著（P＜0.05），试验3组分别较1组、4组极显著提高了6%和8.9%（P＜0.01），试验其他各组差异不显著（P＞0.05）。

表2 日粮止痢草油对公猪精子形态的影响

2.2 血清和精清抗氧化状态 由表3可知，添加显著提高了精清SOD酶活，即整个试验期精清SOD酶活为试验3组 ＞ 2组 ＞ 4组 ＞ 1组（56.8、55.8、 53.4、46.4 U/mL；P ＜ 0.05），且3个OEO添加组之间差异不显著（P＞0.05）。与试验1和4组相比，试验2和3组分别显著提高了整个试验期血清 GSH-Px酶活和试验第16周精清 GSH-Px酶活（P＜0.05）。添加OEO显著降低了第12周血清MDA含量，由低到高依次为试验3组＜2组＜4组＜1组（P＜0.05）。在整个试验期，添加OEO并未显著影响精清MDA含量（P＞0.05）。然而从数值上分析，试验2、3、4组精清MDA数值上较试验1组稍低（2.2、2.4、2.6 nmoL/mL vs. 2.8 nmoL/mL）。

表3 日粮止痢草油对公猪血清和精清抗氧化状态的影响

2.3 精子膜结构和功能 由图1可知，随着试验周的延长，精子膜结构和功能的完整性、膜流动性和MMP增强。在整个试验期，各组公猪精子膜结构完整性、膜功能完整性和MMP均差异不显著（P＞0.05）；试验4组具有降低精子膜流动性的趋势，即整个试验期精子膜流动性为试验4组＜2组＜1组＜3组（P=0.06）。试验2和3组精子膜结构完整性在12周较4组有显著提高，而试验3组精子膜结构完整性和MMP在16周较试验1和4组有显著提高（P＜0.05）。

3 讨 论

大量研究表明，动物饲粮中添加OEO能够明显缓解机体氧化损伤，其主要原因是OEO可提高机体抗氧化能力，并通过自身酚羟基，还原和消除自由基的过量产生[9]。OEO对精子的抗氧化保护作用还未见报道。本研究结果发现，鱼油饲粮添加OEO可提高公猪血清和精清中SOD酶和 GSH-Px酶活，降低血清MDA含量，提高精子膜结构完整性和MMP，从而改善精子形态。

3.1 鱼油饲粮添加OEO对公猪精子血清和精清抗氧化状态的影响 精清存在着丰富的抗氧化酶，SOD和 GSH-Px联合在一起，共同发挥清除活性氧、缓解氧化损伤的作用[8]。本研究发现，试验组添加OEO可显著提高精清SOD活性。升高的SOD将过量的O2-转化为H2O2，同时经 GSH-Px转化分解为水和氧气，从而降低过量的精子活性氧及氧化损伤程度[8-9]。而试验2组和3组提高了血清和精清 GSH-Px酶活，提示试验2组和3组的公猪抗氧化酶系统可全面得到改善，从而在活性氧清除方面较彻底，最终缓解精子氧化损伤。试验4组中OEO添加量增加到750 mg/kg时，血清和精清 GSH-Px酶活并未得到相应的提高。Yue等[9]报道，羊睾丸组织 GSH-Px酶活在低剂量维生素E添加时表现为增强，而高剂量如1 000 IU/（d/头）时并未增强支持目前研究。

图1 精子膜结构和功能

精子氧化应激是造成精子形态缺陷的重要原因[8]。公猪等哺乳动物精子中包含丰富的PUFA，特别是二十二碳六烯酸（DHA），与精子正常形态呈显著正相关[5]；另一方面，由于脱落的细胞质使精子抗氧化物质大量丢失，从而使精子极易遭遇氧化应激[8]。增多的活性氧作用于精子膜脂质后发生过氧化反应，而氧化终产物MDA的含量反映氧自由基介导的脂质过氧化程度。本试验结果发现，随着试验周的延长，各试验组公猪血清MDA含量均有所下降。但添加OEO的试验组血清MDA 含量始终较对照组低。表明鱼油饲粮添加OEO后提高公猪抗氧化酶活，缓解系统的脂质过氧化损伤，从而缓解精子中的氧化损伤[5-10]。试验2组、3组和4组精清MDA数值上较试验1组低，可能间接反映精子氧化损伤程度的缓解。

3.2 鱼油饲粮添加OEO对公猪精子膜功能和精子形态的影响 精子膜结构和功能的完整性是精子形态及受精能力发挥的基础[11]，同时受精子氧化损伤的负调节[12]。为了验证添加OEO对精子膜结构和功能的保护效果，本试验测定了精子膜结构和功能完整性、膜流动性及MMP。本研究发现，试验3组精子膜结构完整性和MMP较1组有显著提高。Pena等[13]报道添加维生素E提高了公猪精子MMP，Surai等[14]报道添加维生素E提高了公鸡精子膜结构完整性，与本研究结果相类似。精子膜完整性和MMP与精子正常形态呈显著正相关[12]。因此试验3组可能是通过提高精子膜结构完整和MMP改善精子形态和受精能力的。试验2组在提高精子膜结构完整性时并未提高MMP，从而未能改善精子形态。而试验4组中OEO添加可能过量。这是因为OEO作为酚类抗氧化剂，还原活性氧自由基后自身转变为自由基，由抗氧化性变为促氧化性[15]，从而损伤精子功能。本研究中试验4组精子膜结构完整性和流动性有降低的趋势，从而未影响精子形态，可能支持上述研究报道。

4 结 论

鱼油饲粮中添加OEO可提高公猪血清和精清中SOD和 GSH-Px酶活，降低血清MDA含量，从而提高抗氧化状态。添加500 mg/kg OEO的饲粮可提高精子膜结构完整性和MMP，从而改善公猪精子形态。

[1] Alm K, Peltoniemi O, Koskinen E, et al. Porcine field fertility with two different insemination doses and the effect of sperm morphology[J]. Reprod Domest Anim, 2006, 41(3):210-213.

[2] Strzezek J, Fraser L, Kuklinska M, et al. Effects of dietary supplementation with polyunsaturated fatty acids and antioxidants on biochemical characteristics of boar semen[J]. Reprod Biol, 2004, 4:271-287.

[3] Surai P, Noble R, Sparks N, et al. Effect of long-term supplementation with arachidonic or docosahexaenoic acids on sperm production in the broiler chicken[J]. J Reprod Fertil, 2000, 120(2):257-264.

[4] Yeste M, Barrera X, Coll D, et al. The effects on boar sperm quality of dietary supplementation with omega-3 polyunsaturated fatty acids differ among porcine breeds[J]. Theriogenology, 2011, 76(1):184-196.

[5] Liu Q, Zhou Y F, Duan R J, et al. Effects of dietary n-6: n-3 fatty acid ratio and vitamin E on semen quality, fatty acid composition and antioxidant status in boars[J]. Anim Reprod Sci, 2015, 162:11-19.

[6] Tan C Q, Wei H K, Sun H Q, et al. Effects of dietary supplementation of oregano essential oil to sows on oxidative stress status, lactation feed intake of sows, and piglet performance[J]. BioMed Res Ⅰnt, 2015,2:1-9.

[7] NRC. Nutrient Requirements of Swine[M]. 11th rev. ed. Washington, DC: National Academy Press, 2012.

[8] Strzezek J. Secretory activity of boar seminal vesicle glands[J]. Reprod Biol, 2002, 2(3):243-266.

[9] Yue D, Yan L, Luo H, et al. Effect of Vitamin E supplementation on semen quality and the testicular cell membranal and mitochondrial antioxidant abilities in Aohan fine-wool sheep[J]. Anim Reprod Sci, 2010, 118(2-4):217-222.

[10] Aldemir M, Okulu E, Kösemehmeto Lu K, et al. Evaluation of the protective effect of quercetin against cisplatin induced renal and testis tissue damage and sperm parameters in rats [J]. Andrologia, 2014, 46(10):1089-1097.

[11] Flesch F M, Gadella B M. Dynamics of the mammalian sperm plasma membrane in the process of fertilization[J]. BBA-Rev Biomem, 2000, 1469(3):197-235.

[12] O'connell M, Mcclure N, Lewis S. The effects of cryopres -ervation on sperm morphology, motility and mitochondrial function[J]. Hum Reprod, 2002, 17(3):704-709.

[13] Pena F, Johannisson A, Wallgren M, et al. Antioxidant supplementation in vitro improves boar sperm motility and mitochondrial membrane potential after cryopreservation of different fractions of the ejaculate[J]. Anim Reprod Sci, 2003, 78(1):85-98.

[14] Surai P, Kostjuk Ⅰ, Wishart G, et al. Effect of vitamin E and selenium supplementation of cockerel diets on glutathione peroxidase activity and lipid peroxidation susceptibility in sperm, testes, and liver [J]. Biol Trace Elem Res, 1998, 64(1-3):119-132.

[15] Lanzafame F M, La Vignera S, Vicari E, et al. Oxidative stress and medical antioxidant treatment in male infertility [J]. Reprod BioMed Online, 2009, 19(5):638-659

Efects of Dietary Supplementation of Oregano Essential Oil on Sperm Morphology, Sperm Membrane and Antioxidant Status in Boars

LⅠU Qing1, DUAN Run-jia1, ZHOU Yuan-fei1, WEⅠ Hong-kui1, PENG Jian1,2*
(1.Department of Animal Nutrition and Feed Science, College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Hubei Wuhan 430070, China; 2.The Cooperative Ⅰnnovation Center for Sustainable Pig Production, Hubei Wuhan 430070, China)

This experiment was aimed to study the effects of oregano essential oil (OEO) supplementation on sperm morphology, sperm membrane and antioxidant status in boars fed with fsh oil-fortifed diet. Thirty-four mature boars of proven fertility, were allocated to one of four groups supplemented with 100 mg/kg vitamin E (group 1, n=8), or 250 (group 2, n = 8) or 500 (group 3, n = 9) or 750 (group 4, n = 9) mg/kg OEO in a completely randomized design for 16 week. Theresults showed that the percentage of sperm with distal cytoplasmic droplet in group 3 was signifcantly lower than that in groups 1 over time (P＜0.01). Ⅰn addition, group 3 had greatest percentage normal morphology of sperm at 16 week (P＜0.01) than group 1 and 4. Throughout experimental period, group 2, 3 and 4 resulted in a increase in the superoxide dismutase (SOD) activity of seminal plasma than that in group 1 (P＜0.05). Group 2 and 3 had greater sperm viability than group 4 at week 12, moreover, group 3 had greater sperm viability and membrane potential (MMP) than group 1 and 4 at week 16 (P＜0.05). These results indicated that OEO dietary supplementation promoted antioxidant capacity in boars, and inclusion of 500 mg/kg OEO into the strengthened fsh oil diet positively afect boar sperm membrane function and morphology.

Boars; Oregano essential oil; Sperm morphology; Sperm membrane; Antioxidant status

S828.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-085

2016-05-07；

2016-07-29

国家科技支撑计划（2014BAD20B01）；湖北省农业创新岗位（2007-620）；湖北省自然科学基金（2013CFA010）；自主科技创新基金培育专项（2662015PY014）

刘庆（1984 -），男，山西忻州人，博士，主要从事动物营养与饲料科学研究，E -mail: liubai126111@163.com

*通讯作者: 彭健，教授，博士生导师，E- mail: pengjian@ mail.hzau.edu.cn