颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛乳腺氨基酸摄取率的影响

张 莹，敖长金，哈斯额尔敦，白 晨，高 鹏，米法英，张腾龙，郑彦楷，温 俊

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018）

颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛乳腺氨基酸摄取率的影响

张 莹，敖长金*，哈斯额尔敦，白 晨，高 鹏，米法英，张腾龙，郑彦楷，温 俊

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018）

本试验旨在研究颈静脉灌注不同组合的油脂对泌乳奶牛乳腺氨基酸摄取率的影响。试验选用体况良好、体重相近，泌乳早期，产奶量25 kg/d左右装有颈静脉插管的荷斯坦奶牛8头，进行4×4拉丁方试验。预试期14 d，每期的试验期12 d，包括5 d灌注期和7 d恢复期。分别从颈静脉灌注处理组（A）橄榄油+红花籽油、处理组（B）橄榄油+胡麻油、处理组（C）红花籽油+胡麻油和处理组（D）橄榄油+红花籽油+胡麻油。在灌注期的最后一天，采集乳样、尾动脉血和乳静脉血。乳样用于测定乳成分，血样用于测定血中氨基酸含量并计算乳腺氨基酸摄取效率。结果表明：当给泌乳奶牛的颈静脉灌注不同组合的油脂后对尾动脉血中Cys和Val的含量差异显著（P＜0.05），Arg和BCAA的含量有差异显著的趋势（P = 0.12；P = 0.08），其余各个AA含量均差异不显著（P＞0.05）；在动静脉差和摄取效率上，单一AA、TAA、EAA、NEAA、BCAA、LAA均差异不显著（P＞0.05）；但B组的动脉氨基酸浓度、氨基酸的动静脉差以及氨基酸的摄取效率均高于其他处理组，但差异不显著（P＞0.05）。泌乳奶牛静脉灌注橄榄油和胡麻油所提供的长链不饱和脂肪酸（C18:1和C18:3）组合对乳腺氨基酸的摄取有一定的促进作用，但表现为低乳蛋白含量。

泌乳奶牛；灌注；油脂；氨基酸摄取

在20世纪五六十年代，学者们通过氨基酸动静脉浓度差和同位素示踪技术的研究均证实泌乳奶牛血液中的游离氨基酸是合成乳蛋白的主要来源。然而影响泌乳奶牛乳蛋白合成的因素有很多，如采食量[1-2]、碳水化合物[3-4]、脂肪[5]和蛋白质[6]等因素。但随着灌注技术的出现，不少学者通过瘤胃后灌注、十二指肠灌注和动静脉灌注来研究乳蛋白的合成情况。有研究报道，给泌乳奶牛十二指肠灌注长链脂肪酸、挥发性脂肪酸、蛋白质和t10,c12-ClA等不同营养底物时发现，其中长链脂肪酸可以增加牛乳中乳脂产量和含量，而蛋白质降低了乳脂含量，但提高了乳脂产量[7]。在泌乳奶牛的日粮中添加油脂不仅增加了乳脂产量，同时也伴随着乳蛋白含量的降低[8]。但Cant等[9]研究发现，奶牛采食添加油脂的日粮后，因乳腺血流量下降而乳腺对血液氨基酸底物摄取的减少，并导致乳蛋白率下降。而现有的结果已经表明，泌乳奶牛在合成乳蛋白和乳脂肪时存在一定的线性关系[10]，但目前通过血插管技术灌注油脂对泌乳奶牛乳腺氨基酸摄取的研究甚少。因此，本试验旨在探讨通过灌注油脂所提供的长链脂肪酸对到达乳腺动脉血液中的氨基酸含量、乳腺氨基酸摄取效率是否产生影响，从而揭示通过灌注乳脂前体物是否对乳蛋白的合成产生影响，进一步为研究泌乳奶牛乳脂肪和乳蛋白的协同互作关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理 试验于2014年9月在内蒙古呼和浩特市奶联社高泉营牧场进行。试验选用体况良好、体重相近，泌乳早期，产奶量25 kg/d左右荷斯坦奶牛8头作为试验动物。采用单栏拴系饲养，从预试期开始饲喂试验饲粮，每天07：00和19：00 2次等量饲喂全混合日粮（TMR），自由饮水；每天06:00和18:00 2次挤奶。试验动物采食保证日剩料量为投料量的5%。在整个试验期每日记录采食量和产奶量。于灌注前一星期在奶牛颈静脉埋置血插管。试验日粮见表1。

表1 日粮组成及营养成分（干物质基础）

1.2 试验设计 3种植物油脂中所含的主要脂肪酸含量见表2。试验采用4×4拉丁方试验设计，4个处理以及配好的灌注乳化液中所提供的脂肪酸含量见表3。预试期14 d，每期的试验期为12 d，其中灌注期5 d，排空期7 d。

表2 橄榄油、红花籽油、胡麻油所含的主要脂肪酸 %

1.3 灌注液的配制及灌注操作 灌注用脂肪乳化液的配置方法参考Lanier等[11]，将各处理组食用油称好后倒入搅拌桶中，边加热边用高剪切乳化机搅拌，当加热至80℃后，向其中加入大豆粉末磷脂，高速搅拌。在另一搅拌桶中加入水和甘油，高速搅拌，加热至60℃。在高速搅拌下将搅拌好的油脂缓缓加入到甘油水溶液中并继续高速搅拌。搅拌好后用NaOH调节pH至8.0，将配好的液体进均质机均质3次，均质好后装瓶，121℃液体高压灭菌15 min。灌注液现用现配。在晨饲开始时持续灌注6 h，不灌注时奶牛自由活动。

1.4 样品的采集与分析 在每个试验期的最后一天分别采集血液样品和乳样。血液的采集位点是尾动脉和乳静脉，分别在07:00、10:00、13:00和16:00采集，采集的血液装在涂有肝素钠的抗凝管中，采集好后轻轻颠倒混匀，在4℃条件下4 000 r/ min离心10 min，将得到的血浆样品按照4个时间点等体积进行混样分装，分装到1.5 mL的无菌离心管中，混好后放入-20℃保存备用，用于测定血浆中游离氨基酸。乳样同样在试验期的最后一天采集，分装到50 mL离心管中，用于测定乳成分。

尾动脉、乳静脉血浆中游离氨基酸浓度的测定方法：用酸水解法进行测定。取混好的血浆 800 μL，加入浓度为8%的磺基水杨酸800 μL，4℃过夜，14 000 r/ min 离心20 min，用注射器吸取上清液，通过0.22 μm滤器过滤到上样瓶中。使用氨基酸自动分析仪进行分析（日立l8900 AA）。

1.5 统计分析 动静脉氨基酸浓度差（mol/L）=尾动脉氨基酸浓度（ μmol/L）-乳静脉氨基酸浓度（ μmol/L）；乳腺氨基酸摄取效率=动静脉氨基酸浓度差（ μmol/L）/动脉血中氨基酸浓度（μmol/L）×100。

试验数据经Excel初步处理后，采用SAS9.1软件进行统计分析，并采用 PROC MIXED模块进行分析，数据为最小二乘均值，显著性水平为P＜0.05，采用Tukey法进行多重比较。

2 结 果

2.1 颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛尾动脉血浆中氨基酸浓度的影响 从表4可以看出，在动脉氨基酸浓度上，B组中Cys和VAL的含量显著高于D组（P＜0.05），Arg和BCAA的含量在4个处理组间有差异显著的趋势（P=0.12；P= 0.08），其余各个单一氨基酸（AA）、总氨基酸（TAA）、支链氨基酸（BCAA）、必需氨基酸（EAA）、非必需氨基酸（NEAA）和限制性氨基酸（LAA）在4个处理组间均差异不显著（P＞0.05）。

表3 不同组合的油脂所提供长链不饱和肪酸的量

表4 颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛尾动脉血浆中游离氨基酸含量的影响 μmol/L

2.2 颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛动静脉浓度差的影响 由表5可知，各个单一AA、TAA、EAA、NEAA、BCAA、LAA的含量在A、B、C和D，4个处理组间均差异不显著（P＞0.05），但从数值上看，B处理中大部分氨基酸的动静脉差的值高于其他3个处理组。

2.3 颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛乳腺氨基酸摄取率的影响 由表6可知，各个单一AA、TAA、EAA、NEAA、BCAA、LAA的含量在A、B、C和D 4个处理组间均差异不显著（P＞0.05）。对必需氨基酸摄取的次序：A组为Met ＞ Arg ＞ Leu ＞ Lys＞ Thr＞ Ile ＞ VaL ＞ His ＞ Phe，B组为Lys＞ Arg ＞ Leu＞ Thr ＞ Met ＞ Ile ＞ His ＞ Phe ＞ VAL，C组 为Lys ＞ Arg ＞ Met ＞ Leu ＞ Ile ＞ His＞ Phe ＞ VAL ＞ Thr，D组为Arg ＞ Lys ＞ Leu＞ Met＞ Thr ＞ His ＞Val ＞ Phe。从摄取次序上可以看出，泌乳奶牛乳腺乳腺对Lys和Met仍为最先摄取，但通过灌注后Arg摄取次序也在先。从数值上看，不论是动脉氨基酸浓度、动静脉浓度差还是摄取率上，基本上是B组＞A组＞D组＞C组。

2.4 颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛乳蛋白含量和产量的影响 从表7可以看出，颈静脉灌注不同组合的油脂后，乳蛋白含量差异显著（P＜0.05），乳蛋白产量在4个处理组间差异不显著（P＞0.05）；各处理间乳蛋白产量下降，但乳蛋白含量升高。

3 讨 论

3.1 颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛乳腺氨基酸摄取的影响 补充脂肪酸的量和组成以及方式均会影响上述效应的程度。泌乳奶牛乳腺合成蛋白质所用的氨基酸原料主要是通过一定的机制从阴外动脉血液中摄取而获得[12]。而乳腺动脉血液中氨基酸的浓度是影响乳腺对氨基酸吸收的主要因素[13]。刘娜等[14]研究表明，通过采集泌乳奶牛尾动脉血液来代替阴外动脉血液，其血液组成可以代表阴外动脉血管中血

液的组成，进而研究泌乳奶牛乳腺对氨基酸的摄取和利用。所以本次试验采集尾动脉血进而研究泌乳奶牛乳腺氨基酸摄取效率。动脉血中氨基酸浓度是衡量乳腺氨基酸摄取的一个动态标志，而通过动静脉浓度差进一步能说明乳腺氨基酸的摄取程度，从而看出泌乳奶牛乳蛋白率和乳蛋白产量的合成情况。

表5 颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛动静脉氨基酸浓度差的影响 μmol/L

表6 颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛乳腺氨基酸摄取效率的影响 %

表7 颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛乳蛋白含量和乳蛋白产量的影响

Guinard等[15]研究表明，给泌乳奶牛十二指肠梯度灌注酪蛋白后，动脉血中氨基酸浓度和乳腺对必需氨基酸和非必需氨基酸的摄取率随着灌注量的增加而呈线性增加，其中动脉血中必需氨基酸浓度要高于非必需氨基酸浓度，在摄取率上也呈现这样的趋势。而本试验中，虽然是灌注不同组合的油脂，但每个处理的单一氨基酸的浓度差与摄取率间保持一致，这一趋势与Guinard等[15]的试验所得到的趋势相一致。

王新朋[16]的研究结果表明，通过阴外动脉灌注脂肪酸对血浆中TAA、BCAA、EAA、LAA和大部分单一氨基酸浓度的差异均不显著，NEAA、Ile和Leu浓度之间差异显著，原因可能是在灌注乳脂肪前体物使得血浆中的脂肪酸浓度升高，使血浆中氨基酸的浓度降低，血流速度下降，导致氨基酸的浓度相应降低。目前关于通过灌注油脂所提供的长链不饱和脂肪酸对乳腺氨基酸摄取率方面的研究较少。

在本试验条件下，处理组B回撤红花籽油（C18:2）中，Cys和VAL的含量差异显著，这可能是C18:2对Cys和VAL的合成有一定的抑制作用。从表中的数据还可以看出，Arg和BCAA的含量有差异显著的趋势，其余各个氨基酸均不显著，说明可能回撤长链不饱和脂肪酸没有对氨基酸浓度产生额外的促进或者抑制作用。在动静脉差和摄取率上，Gly和Cys为负值，这并不代表着乳腺对Gly和Cys不摄取，而是摄取量少。在乳腺对氨基酸摄取率上，4个处理组间， B组值最高，说明通过回撤红花籽油C18:2可能抑制乳腺氨基酸的摄取，这与动脉血中氨基酸浓度呈正相关，而必需氨基酸的摄取次序上，排在第1位和第2位的均是Lys和Met，说明无论是在日粮中添加脂肪还是通过灌注脂肪前体物，泌乳奶牛的限制性氨基酸仍是Lys和Met。而本试验通过灌注也可以看出乳腺对Arg的摄取率较高，原因是Arg是乳腺中一氧化氮合成的前体物[17]，而通过灌注油脂所提供的长链不饱和脂肪酸可能对Arg有一定的作用。不论是动脉血中氨基酸浓度、动静脉差还是乳腺氨基酸摄取效率，B组的数值均高于其他3个处理组。

3.2 颈静脉灌注油脂对泌乳奶牛乳蛋白合成的影响在乳蛋白含量上，B组较其他3个处理组数值最低，而在动静脉差、摄取效率上都是处理组B在数值上高于其他3个处理组，这说明通过额外灌注油脂产生了所谓的“稀释效应”，使得乳蛋白含量较低。而有研究报道，较高剂量的额外油脂添加（添加量大于400～500 g/d）对乳蛋白含量有显著降低或降低趋势[18-19]。王强[20]研究表明，在不同NFC/NDF日粮条件下，对关中奶山羊阴外动脉灌注不同氨基酸模式，当日粮NFC/NDF为1.03，阴外动脉灌注必需氨基酸6.03 g/d时，乳腺对乳成分前体物的摄取最佳。总之，乳腺组织对乳成分前体物的摄取利用可能存在一定的协同或竞争作用。而本试验通过灌注不同组合油脂中所提供的长链不饱和脂肪酸，不同的组合对乳腺氨基酸的合成作用也不一样，或是促进或是抑制。

4 结 论

通过给泌乳奶牛灌注不同组合的油脂所提供的长链不饱和脂肪酸对乳腺氨基酸的合成都有一定促进作用，但灌注橄榄油和胡麻油组所提供的长链不饱和脂肪酸（C18:1和C18:3）表现为低的乳蛋白含量，灌注橄榄油和红花籽油组所提供的长链不饱和脂肪酸（C18:1和C18:2）最终表现为高乳蛋白产量。

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Efect of Oil Infusion into Jugular Vein on Mammary Gland A mino Acid Uptake Rate in Lactating Dairy Cows

ZHANG Ying, AO Chang-jin*, KHAS-Erdene, BAⅠ Chen,GAO Peng, MⅠ Fa-ying, ZHANG Teng-long, ZHENG Yan-kai, WEN Jun
(College of Animal Science, Ⅰnner Mongolia Agricultural University, Ⅰnner Mongolia Hohhot 010018,China)

The objective of this study is to investigate the efect of diferent oil infusion into the jugular vein of lactating dairy cows on the mammary gland amino acids extraction uptake. First, the 4 x 4 Latin square was designed, and choosing eight Lactating Holstein cows with good body condition , similar weight and about 25 kg/d milk yield .There were a 14-day acclimation period before experiment and trial period of 12 days, including infusion period of 5 days and recovery period of 7 days. The study had four stages when Holstein cows would be infused into four diferent kinds of fat through jugular vein. Group A were olive oil and safower oil,B for olive oil and fax seed oil,C for olive oil and fax seed oil, and D for olive oil , safower oil and fax seed oil. On the last day of the infusion period,we collected milk samples, caudal artery blood and mammary vein blood, the acquisition of milk sample for the determination of milk composition and blood collected for determination of amino acids content in the blood, and calculate the mammary amino acids uptake efciency.The result showed,the fat infused into jugular vein of lactating dairy cows of four diferent treatment group after oil, amino acids content of Cys and Val between the treatment group were difevent (P ＜ 0.05), the content of Arg and branched chain amino acids are diferent signifcant trend (P = 0.12; P = 0.08), and the rest of the content of amino acids were not signifcantly diferent (P ＞ 0.05). On arterial venous diference and uptake efciency, four treatment groups between single amino acid, TAA,EAA, NEAA,BCAA, LAA were not signifcantly diferent(P ＞ 0.05).Ⅰn the treatment group B, the arterial amino acids concentration, the arterial venous diference of the amino acids and the extraction rate of the amino acids were higher than that of the other groups, but the diference was not signifcant(P ＞ 0.05).This suggested that the long chain unsaturated fatty acids (C18:1 and C18:3) provided by the intravenous infusion of olive oil and fax seed oil in lactating dairy cows had a certain efect on the uptake of amino acids.

Lactation cows; Ⅰnfusion; Oil; Amino acid uptake

S823.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-055

2016-05-31；

2016-07-16

国家奶业973计划（2011CB100803）

张莹（1990-），女，吉林白山人，硕士，主要从事反刍动物营养与畜产品品质的研究，E-mail：413995254@ qq.com

*通讯作者：敖长金，教授，博士生导师，E-mail：changjinao @aliyun.com