HPLC法同时测定血府逐瘀水蜜丸中3个易热解成分的含量

上官同强 韩风雨 于秀玲* 齐 平 李洪泽

1.内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司，内蒙古 赤峰 024000；2.内蒙古博奥现代蒙中药技术研究有限公司，内蒙古 赤峰 024000；3.内蒙古天奇药业集团有限公司，内蒙古 赤峰 024000



HPLC法同时测定血府逐瘀水蜜丸中3个易热解成分的含量

上官同强1韩风雨3于秀玲1*齐 平2李洪泽2

1.内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司，内蒙古 赤峰 024000；2.内蒙古博奥现代蒙中药技术研究有限公司，内蒙古 赤峰 024000；3.内蒙古天奇药业集团有限公司，内蒙古 赤峰 024000

目的：建立高效液相色谱法(HPLC)测定血府逐瘀水蜜丸中梓醇、羟基红花黄色素A、藁本内酯三种指标成分含量的方法。方法：采用DIKMA Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为流动相A(甲醇 ∶乙腈=80 ∶20)，流动相B：0.5%磷酸水溶液，体积流量1.0mL/min，梯度洗脱0～8min，98%B；8～20min,98%→75%B；20～21min，75%→40%B；21～40min，40%B；分段波长检测：0～8min为210nm、8～25min为 403nm、25～40min为280nm，柱温30℃，进样量10μL。结果：各成分色谱峰之间有良好的分离度，梓醇进样量在0.199～1.989μg(r2=0.9995)，羟基红花黄色素A进样量在0.0392～0.392μg(r2=0.9991)，藁本内酯进样量在0.0204～0.204μg(r2=0.9992)与峰面积呈良好线性关系；平均回收率在99.21%～100.92%，RSD均小于2.0%；样品中平均含量为：梓醇0.07%、羟基红花黄色素A 0.09%、藁本内酯 0.05%。结论：该检测方法操作简便，结果准确可靠，可以真实反映血府逐瘀水蜜丸在干燥过程中的质量变化。

血府逐瘀水蜜丸；高效液相色谱法；梓醇；羟基红花黄色素A；藁本内酯

血府逐瘀丸由血府逐瘀汤剂改成，血府逐瘀丸主要由柴胡、当归、生地、桃仁、红花、赤芍、麸炒枳壳、桔梗、牛膝、川芎、甘草11味药组成。是活血化瘀治则的基本方剂之一，具有活血化瘀、理气止痛的功效,抗炎消肿，调节人体免疫功能，行气活血化瘀，改善血液循环，促进周围微循环畅通，解除组织瘀血，缺血、促进渗出物吸收，恢复视力等作用[1]。方中桃仁、红花活血化瘀，为君药；赤芍、当归和川芎能够增强主药的功效，为臣药。

近年来，水蜜丸较大蜜丸具有服用便宜的优势，在市场中越来越受到人们的认可。现行标准中国药典2015版标准[2]，只有大蜜丸质量标准，并无水蜜丸的质量标准。而水蜜丸的生产过程中较大蜜丸增加了干燥过程，可能导致制剂中有效成分损失。鉴于此，研究以血府逐瘀水蜜丸湿丸为研究材料，利用常温晾干，60℃烘干，70℃烘干，80℃烘干四种干燥方式，通过测定羟基红花黄色素A[3-5]、梓醇[6-7]、藁本内酯[8-9]成分含量，并作出综合评价，拟筛选出最适合血府逐瘀水蜜丸干燥的方法，为血府逐瘀水蜜丸质量标准制定提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 日本Shimadzu LC-20A高效液相色谱系统(包括SIL-20AC Autosampler自动进样器，DGU-20A3R Degassing Unit 脱气单元，LC-20AT Solvent Delivery Unit 溶液输送单元，CTO-20AC Column Oven柱温箱，SPD-M20A Photodiode Array Detector高灵敏度二级管阵列检测器，LabSolutions LC Workstation Ver.5 Multi LC-PDA (中文版)数据工作站，CBM-20Alite System Controller 网络化系统控制器)；MS105DU电子天平(十万分之一，瑞士梅特勒公司)；BDGC-EH-S-9型电热烘箱(河南勃达微波装备股份有限公司)，YUJ-16A制丸机(天水华圆制药设备科技有限责任公司)，CHJ-150槽混机(天水华圆制药设备科技有限责任公司)。1.2 材料 羟基红花黄色素A(批号：111637-201308)、梓醇(批号：110808-201210)、藁本内酯(批号：111737-201507)均购于中国药品生物制品检定所。血府逐瘀药粉(批号：20160301)、炼蜜(批号：20160311)来源于内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司。甲醇(批号：876002)、乙腈(批号：876001)为VBS公司产品，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 血府逐瘀水蜜丸的制备 取血府逐瘀药粉，过120目，加入适量炼蜜及水，合坨，制丸，抛光，选丸，按以下条件进行干燥备用，详见表1。常温干燥：取200g湿丸，平铺筛网上，置于室内通风干燥处阴干，至样品水分低于8.0%。加热烘干：取200g湿丸三份，平铺筛网上，置于电热恒温烘箱中，分别以60℃、70℃、80℃干燥至样品水分低于8.0%。

表1 干燥样品信息

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取羟基红花黄色素A、梓醇、藁本内酯对照品适量，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取单个组分对照品溶液，用50%甲醇稀释制成混合对照品储备溶液，其中含羟基红花黄色素A 40μg/mL，梓醇 200μg/mL，藁本内酯20μg/mL ；取混合对照品储备溶液稀释2倍作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取1.0g精密称定，精密加入50%甲醇10mL，称重，超声40min取出，放凉，补足重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 取除红花、川芎、当归、地黄外的各味药材，按水蜜丸制备方法及供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。2.3 色谱条件色谱柱 DIKMA Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A：甲醇：乙腈=80∶20；流动相B：0.1%磷酸水溶液，体积流量1mL/min，梯度洗脱0～8min，98%B；8～20min,98%→75%B；20～21min，75%→40%B；21～40min，40%B；分段变波长测定：0～8min为210nm,8～25min为403nm，25～40min为280nm[10-12]；柱温30℃；进样量10μL，进样器温度4℃。

2.4 方法学考察2.4.1 专属性考察 取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按照“2.3”色谱条件进行测定，结果供试品中各待测成分色谱峰的分离度均大于1.5，其他杂质峰与阴性溶液对待测成分均无干扰。见图1。

2.4.2 线性关系考察 精密吸取按“2.2.1”项下方法制备的混合对照品储备液1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0mL，分别置于10mL量瓶中，用流动相A定容，摇匀，与储备液一起作为系列质量浓度的混合对照品溶液。分别吸取上述系列混合对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，得回归方程：梓醇Y=5.0275X-4.7431，r2=0.9995，线性范围19.89～198.9μg；羟基红花黄色素AY=7.3722X+3.3089，r2=0.9991，线性范围3.92～39.2μg；藁本内酯Y=12.6X+15.495，r2=0.9992，线性范围2.04～20.4μg。见图2。

2.4.3 精密度考察 精密吸取线性关系考察项下中间质量浓度的混合对照品溶液，连续进样6次，按上述色谱条件注入液相色谱，记录色谱图，测定各待测物质峰面积值。结果梓醇、羟基红花黄色素A、藁本内酯峰面积的RSD分别为0.74%、1.48%、1.33%，表明精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别与0、2、4、6、8、12h按上述色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，测定各待测成分峰面积。结果供试品溶液在12h内色谱峰面积无明显变化，梓醇、羟基红花黄色素A、藁本内酯的RSD分别为1.32%、1.95%、1.88%，表明供试品溶液在制备后12h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取同一批样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定各物质的量。结果梓醇、羟基红花黄色素A、藁本内酯的平均质量分数分别为0.07%、0.09%、0.051%，RSD分别为1.37%、1.51%、1.91%。

2.4.6 回收率试验 取2.4.5项下的样品6份，每份约1.0g，精密称定，分别精密加入对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品，照上述色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。结果梓醇、羟基红花黄色素A、藁本内酯的平均回收率为100.44%、99.21%、100.92%。2.5 样品测定 取血府逐瘀药粉，过120目，加入适量炼蜜及水，合坨，制丸。分别置于80℃、70℃、60℃、常温条件下干燥。按“2.2.2”项下方法制备供试品，照上述色谱条件注入液相色谱，记录色谱图，与常温条件下样品比较，计算相对含量。结果见表2。

表2 样品测定结果

3 讨论

地黄中梓醇的检测波长为210nm，红花中羟基红花黄色素A检测波长为403nm，川芎和当归中的藁本内酯的检测波长为280nm，各成分之间紫外吸收情况差异较大，为提高分析方法的灵敏度，采用单标检测确定各成分保留时间，采用分时段波长对三种成分进行测定，最终各成分均在各自最大吸收波长处分别检测，响应信号好，其他成分干扰小，提高了方法的专属性。

实验中的三种成分热稳定性均不好，选用超声提取。且血府逐瘀水蜜丸化学成分非常复杂，各成分极性不一致，实验分别考察了甲醇、乙腈与水相不同比例的提取效果，以及超声时间对测定结果的影响，结果发现甲醇：0.5%磷酸水溶液=1∶1，超声40min时，三种成分组分提取基本完全。故本实验的提取方法为以甲醇：0.5%磷酸水溶液=1∶1为溶剂，超声40min。对3种指标成分进行HPLC分析时，对流动相系统组成比例进行筛选，比较了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-乙腈-0.1%磷酸、甲醇-乙腈-0.1%甲酸构成的洗脱系统，分别进行等度与梯度洗脱。结果表明，甲醇-乙腈-0.1%磷酸系统进行梯度洗脱的分析效果较好。

血府逐瘀水蜜丸与已有国家药典标准的血府逐瘀大蜜丸相比，制剂工艺中增加了加热干燥过程，而且中药复方制剂化学成分复杂。为更有效保证药品质量，全面提升药品质量控制标准，实验采用HPLC法同时测定血府逐瘀水蜜丸中梓醇、羟基红花黄色素A及藁本内酯三种热不稳定性成分的含量。该方法重现性好，操作简便，结果准确可靠，能够综合评价血府逐瘀水蜜丸在干燥后的内在质量，在药典标准的基础上提高了血府逐瘀丸的质量控制水平，可用于血府逐瘀水蜜丸的制剂工艺研究中干燥温度的考察及控制中间体的质量，并为血府逐瘀水蜜丸的质量标准的制定提供依据。

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(编辑：穆丽华)

Simultaneous Determination of Three Labile Pyrolysis Components in Xuefuzhuyu Water-honeyed Pill by HPLC

Shangguan Tongqiang1HAN Fengyu3YU Xiuling1*QI Ping2LI Hongze2

1.Inner Mongolia Tianqi Han&Mongolia Pharmaceutical Co, Chifeng 024000,China； 2.Inner MongoliaInner Mongolia Boao Modern Mongolian-Chinese Medicine Technology Research co, Chifeng 024000,China； 3.Inner Mongolia TianqiPharmaceutical industry investment Co, Chifeng 024000,China

Objective To establish an HPLC method for the dete1rmination of catalpol、hydroxysafflor yellow A、ligustilide in Xuefu Zhuyu Water-honeyed Pill.Methods Three target components were separated byDIKMA Diamonsil C18(2) column (250 mm × 4.6 mm, 5.0 μm) with a gradient mobile phase consisting of methanol-acetonitrile (80 ∶20, A)-0.5% phosphoric acid (B) (0～8.0 min, 98% B; 8.0～20.0 min, 98%→75% B; 20.0～21.0 min,75%→40% B;21.0～40.0 min,40% B)at a flow rate of 1.0 mL/min,and simultaneously quantificated by variable detection wavelength: 0～8.0 min, 210 nm; 8.0～25.0 min, 403 nm; 25.0～40.0 min, 280 nm.The column temperature was 30℃and injection volume was 10 μL.Results The calibration curve of catalpol、hydroxysafflor yellow A and ligustilide were linear within 0.199～1.989μg(r2=0.9995), 0.0392～0.392μg(r2=0.9991) and 0.0204～0.204μg (r2=0.9992).The average recovery rates were 99.21%～100.92%,RSDwas all below 2.0%.The average contents of catalpol、hydroxysafflor yellow A and ligustilide in Xuefu Zhuyu Water-honeyed Pill were 0.07%, 0.09% and 0.051%.Conclusion The method is simple, accurate and reliable for the quality control of Xuefu Zhuyu Water-honeyed Pill.

Xuefu Zhuyu Water-honeyed Pill; HPLC; Catalpol ;Hydroxysafflor yellow A; Ligustilide

2016-10-21

上官同强(1978-)，男，汉族，本科，主要从事中药制剂、化药合成等领域的应用研究。E-mail:751067671@qq.com

于秀玲(1984-)，女，汉族，硕士，主要从事生物技术在药品、食品领域的应用研究。E-mail:343981667@qq.com

R914.1

A

1007-8517(2017)01-0012-04