丰富环境对小鼠缺血性脑损伤后运动、社交功能的作用①

姜敏，王继先，余波，杨国源，陈文华

丰富环境对小鼠缺血性脑损伤后运动、社交功能的作用①

姜敏1，王继先2，余波1，杨国源3，陈文华1

目的研究长期丰富环境对促进小鼠缺血性脑损伤后运动、社交功能恢复的作用。方法成年雄性ICR小鼠16只，复制大脑中动脉永久性栓塞模型。术后第1天将小鼠分为丰富环境组(n=8)和标准环境组(n=8)。术后7 d、14 d、21 d、28 d对小鼠进行改良神经损害严重程度评分(mNSS)，进行疲劳转棒仪、聪明笼子检测。结果术后28 d，丰富环境组mNSS评分与转棒疲劳试验结果优于标准环境组(t＞2.927,P＜0.05)。一般运动试验中，术后14～28 d，丰富环境组在聪明笼子中间区域出现的时间长于标准环境组(t＞2.480,P＜0.05)；社交行为试验中，术后7～28 d，丰富环境组比标准环境组表现出对陌生小鼠更感兴趣的趋势，但无显著性差异(P＞0.05)；术后14～28 d，丰富环境组出现在中间区域的时间明显长于标准环境组(t＞3.472,P＜0.01)；术后14 d在聪明笼子中的移动速度高于标准环境组(P＜0.05)。结论丰富环境有助于小鼠缺血性脑损伤后运动功能恢复，并可能促进其社交功能恢复。

缺血性脑损伤；丰富环境；运动；社交；行为；小鼠

[本文著录格式] 姜敏，王继先，余波，等.丰富环境对小鼠缺血性脑损伤后运动、社交功能的作用[J].中国康复理论与实践, 2017,23(1):32-36.

CITED AS:Jiang M,Wang JX,Yu B,et al.Effect of enriched environment on motor and social function after ischemic brain injury in mice[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(1):32-36.

脑卒中是一种由脑供血障碍导致的急性综合征，其中约80%为供血受阻导致的缺血性脑卒中[1]。康复训练在脑卒中后功能恢复中发挥重要作用，绝大多数患者可以通过康复训练达到生活自理。除常规康复训练及治疗可以帮助脑卒中患者外，改善患者的社交及生活环境也可以影响功能恢复的进程[2-3]。

在动物实验中，丰富环境是一种很好的促进功能恢复的治疗方式，它通过为实验动物提供较大的活动空间、多种玩具，增强对动物运动、感觉、认知及社交的刺激，激发其对新环境的探索欲望，从而引发自主运动，达到促进动物社交、感觉与运动功能恢复的效果。现有的研究表明，丰富环境不仅可以在细胞和分子层面产生影响[4-6]，也可与多种其他治疗相互作用[7]；不管是在脑缺血的急性期还是慢性期介入均可发挥一定的治疗作用，即便在脑缺血前进行干预[8]，也可对动物有一定的保护作用。

本研究探讨丰富环境对小鼠缺血性脑损伤后运动、社交功能恢复的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级雄性ICR小鼠16只，体质量25～30 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。造模后，小鼠分为丰富环境组和标准环境组，每组8只，术后第1天分别饲养于丰富环境或标准环境中。

1.2 实验仪器与试剂

聪明笼子(smart cage)：AFASCI Inc.Burlingame, CA。手术显微镜：LEICA,Heerbrugg,Switzerland。Moor VMS-LDF激光多普勒血流仪：Moor Instruments,Aminster,Devon,UK。

1.3 模型制备

采用大脑中动脉永久性栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。氯胺酮100 mg/kg和甲苯噻嗪10 mg/kg麻醉并固定好动物。参照文献[9]，分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉后，用一端包有硅胶的6-0丝线阻塞小鼠左侧大脑中动脉。手术过程中通过电热毯保持动物体温(37±0.5)℃。通过激光多普勒血流仪检测术前及术后同一部位，如血流降至术前20%以下为手术成功。

1.4 丰富环境与标准环境

丰富环境笼子40×30×40 cm，分为上下两层，中间有塑料隧道、爬梯及平台连接，两层均放有不同颜色的玩具，如塑料隧道、小房子、小鼠跑轮、跑球、木质翘板等。每3天添加或移除一些玩具，并更换摆放位置。一般同时放入5～10只小鼠以保证对动物的社交刺激。

标准环境即为实验小鼠常规饲养环境。

1.5 行为学评估

1.5.1 改良神经损害严重程度评分(modified Neurological Severity Score,mNSS)

mNSS可以综合评估动物运动、感觉、反射及平衡能力，评分范围0～18分[10]。分数越高表示损伤越重。评分由对实验分组不知情的研究人员于造模术后7 d、14 d、21 d、28 d完成。

1.5.2 转棒疲劳试验[11]

术前3 d对动物进行训练。第1天将小鼠放于静止的转棒上，使其停留30～60 s；然后使转棒从5 r/min匀加速至20 r/min，掉落的动物重新放于转棒上，直到可以停留60 s。第2及第3天的训练改为从5 r/min匀加速至40 r/min。选择第3天可以自主在转棒上停留1～2 min的动物进行试验，重复3次，取平均值。造模术后7 d、14 d、21 d、28 d，动物每天测试3次，间隔5～10 min，记录动物停留的时间，取平均值。

1.5.3 聪明笼子

用来记录小鼠的自主活动[12-14]。通过探测并记录小鼠在不同区域的移动轨迹、距离、速度、活跃时间等参数，分析动物运动及社交功能。

聪明笼子自带软件可以将笼内区域横向分为4个或纵横分为9个区域。错步模块(foot drop)采用9分法，其中5区为笼内最中间的区域；社交行为模块采用4分法，其中1区代表陌生小鼠区域，4区代表熟悉小鼠区域。

于造模术后7 d、14 d、21 d、28 d，通过错步模块记录小鼠在笼内15 min内的一般运动情况，记录5～10 min时间内停留在5区的时间；通过社交行为(social behavior)模块对小鼠的社交行为进行检测。社交行为检测共30 min：将待测动物放入笼内适应环境10 min，再将其熟悉的正常小鼠放入挂在笼子一侧的透明盒内(盒底部为铁丝网，方便动物交流)10 min，在笼子的另一侧放入相似体质量的陌生正常小鼠10 min，记录实验小鼠在笼内各区域的运动轨迹、速度及活跃时间。

1.6 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。计量资料用(±s)表示，组间比较采用成组比较t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 mNSS

术后28 d，丰富环境组mNSS评分明显低于标准环境组(P＜0.01)。见表1。

表1 各组小鼠mNSS评分比较

2.2 运动功能

转棒疲劳试验显示，丰富环境组术后28 d停留在转棒上的时间长于标准环境组(P＜0.05)。见表2。

表2 各组小鼠在转棒上停留时间比较(s)

聪明笼子错步试验显示，丰富环境组术后14 d、21 d、28 d出现在第5区的时间均长于标准环境组(P＜0.05)。见表3。

表3 各组小鼠错步试验在5区停留时间比较(min)

2.3 社交功能

聪明笼子社交行为试验显示，丰富环境组术后14 d开始在1区停留的时间有降低趋势，但与标准环境组无显著性差异(P＞0.05)。见表4。

通过以下公式进一步分析放入陌生小鼠后实验小鼠在1区出现的时间的变化率(A)，正值表示对陌生小鼠更感兴趣。

其中zone110～20表示放入熟悉小鼠后实验小鼠在1区停留的时间；zone120～30表示放入陌生小鼠后实验小鼠在1区停留的时间。

处理后，丰富环境组总体上比标准环境组对陌生小鼠更感兴趣。见表5。

通过对进行社交行为试验的小鼠进行观察，发现丰富环境组小鼠普遍较活跃，小鼠在1区停留时间降低可能为小鼠在笼内其他区域活动时间增多所致。使用9分法分析放入陌生小鼠后，实验小鼠在5区停留时间所占的比率。结果显示，从术后14 d开始，丰富环境组5区停留时间高于标准环境组。见表6。

结合实验中观察到丰富环境组小鼠不停往返穿行于1区与4区之间(4分法)，推测放入陌生小鼠后，实验小鼠在1区和4区停留时间无显著性差异的原因可能是由于丰富环境组运动功能恢复，在笼内各区活动均较活跃，从而掩盖了社交行为的恢复水平。

我们对小鼠术后7 d和14 d进行社交行为试验时的速度进行观察，结果显示，标准环境组7 d、14 d的速度没有明显改变，丰富环境组14 d时的速度高于标准环境组。提示运动功能于术后14 d开始恢复。见图1。

表4 各组小鼠社交行为试验在1区停留时间比较(min)

表5 各组小鼠社交行为试验A值比较

表6 各组小鼠社交行为试验放入陌生小鼠后实验小鼠在5区停留时间比率比较

图1 小鼠社交试验造模术后7 d、14 d的移动速度

3 讨论

环境可以影响身体健康的观点已被多数人认可，丰富环境正是通过改变实验动物的生存环境，发挥治疗作用。在临床工作中，脑卒中患者在医院进行康复时多不积极，较好的环境及社交支持有利于提高患者的积极性与参与性，帮助改善患者的心情[2]，从而影响最终的治疗效果。研究表明，丰富环境可以调节脑缺血后特定基因的表达[4,15-16]，减轻炎症反应[17]，调控多种营养因子及再生过程[18]，引发突触再生、胶质细胞再生、血管再生等一系列促进脑可塑性的过程[19-21]，最终使功能得到恢复。此外，丰富环境还可与多种治疗协同作用[7]，共同促进脑缺血后的功能恢复，不管是在急性期、慢性期或缺血前[8]进行干预，均可发挥有益作用。

本研究发现，长期(28 d)丰富环境能明显促进脑缺血小鼠运动功能恢复。

聪明笼子是一种可以记录小鼠移动轨迹、距离、速度、活跃时间等参数，并对运动、社交等功能进行定量分析的实验装置。国外使用此装置主要观察动物在某一时间点的功能情况[22-23]，针对脑卒中后功能恢复的研究主要限于急性期[12]，缺乏对动物长期功能恢复的观察。本研究对MCAO小鼠观察28 d，着重分析长期丰富环境对小鼠运动、社交功能恢复的作用，发现丰富环境不仅有利于运动功能的恢复，对社交功能的恢复可能也有一定帮助。

聪明笼子的社交行为试验与已经广泛应用的物体识别试验[24]相似，利用动物对新物体比旧物体有更大兴趣的特点，研究动物的认知与记忆功能。在社交行为试验中，将新、旧物体换为实验动物陌生或熟悉的小鼠，观察动物与同伴进行识别与交流的能力。

本研究发现，当笼内同时出现熟悉和陌生小鼠时，丰富环境组小鼠对陌生小鼠更感兴趣，表现为在陌生小鼠所在区域停留时间较长，但这一差异随时间逐渐减小。进一步分析发现，从术后14 d开始，丰富环境组小鼠出现在中间区域的时间长于标准环境组，移动速度高于标准环境组，提示丰富环境组运动功能恢复好于标准环境组；可能由于在笼内各区的活动均比较活跃，从而掩盖了社交功能的真实恢复水平。

综上所述，丰富环境有助于小鼠缺血性脑损伤后的功能恢复，在运动功能显著恢复前，还可能对社交功能恢复产生有利作用。

临床上很多患者在脑卒中后的康复治疗中表现不积极，类似丰富环境的治疗可以调动他们的治疗积极性，达到促进功能恢复的目的[2,25]。

已有临床研究表明，患者需要更接近日常生活的环境来帮助恢复受损功能，康复治疗并非项目越多、治疗强度越大，效果越好[3]。如何将丰富环境中关于运动、感觉、社交及认知等方面的有益刺激转换到临床治疗中是需要今后探讨和研究的问题。

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Effect of Enriched Environment on Motor and Social Function after Ischemic Brain Injury in Mice

JIANG Min1,WANG Ji-xian2,YU Bo1,YANG Guo-yuan3,CHEN Wen-hua1
1.Department of Rehabilitation Medicine,Shanghai General Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200080,China;2.Department of Rehabilitation Medicine,Shanghai Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China;3.Med-X Research Institute,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200030,China

CHEN Wen-hua.E-mail:chen.wh@163.com

ObjectiveTo explore the role of long-term enriched environment in promoting the recovery of motor and social function in mice after ischemic brain injury.MethodsSixteen adult male ICR mice underwent permanent middle cerebral artery occlusion(MCAO). The first day after operation,they were divided into enriched environment group(n=8)and standard condition group(n=8).The mice were tested with modified Neurological Severity Score(mNSS),rotarod test and smart cage 7,14,21,28 days after modeling.ResultsThe score of mNSS and the result of rotarod test improved more in the enriched environment group than in the standard condition group 28 days after MCAO(t＞2.927,P＜0.05).The occupancy time in the middle of smart cage was longer in the enriched environment group than in the standard condition group 7 to 28 days after MCAO(t＞2.480,P＜0.05)in the general move test.There was a trend of being more interested in strange mice in the enriched environment group than in the standard condition group,but the difference was not statistically significant(P＞0.05)in the social behavior test;however,the occupancy time in the middle of smart cage was longer in the enriched environment group than in the standard condition group 14 to 28 days after MCAO(t＞3.472,P＜0.01),and the velocity of moving was higher 14 days after MCAO(P＜0.05).ConclusionEnriched environment could promote the recovery of motor function,somehow of social function,in mice after ischemic brain injury.

ischemic brain injury;enriched environment;motor;sociality;behavior;mice

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.01.08

R743.3

A

1006-9771(2017)01-0032-05

2016-07-15

2016-10-26)

上海市科委产学研医项目(No.11DZl921307)。

1.上海交通大学附属第一人民医院康复医学科，上海市200080；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院康复医学科，上海市200025；3.上海交通大学Med-X研究院，上海市200030。作者简介：姜敏(1988-)，女，汉族，上海市人，硕士研究生，主要研究方向：神经康复。通讯作者：陈文华，女，汉族，主任医师，教授。E-mail:chen.wh@163.com。