MiRNA—351在小鼠卵泡发育中的调控作用实验

董静文+黄青

[摘要]目的探究MiRNA一351在小鼠卵泡发育中的调控作用。方法选取60只雌性白鼠开展实验，分别于出生第5、7、11、14天和第20天处死（每次处死12只），获取卵巢后经相应处理并采取RT-PCR测定不同时刻MiRNA-351表达情况，并分析该基因表达在小鼠卵泡发育中调控作用。结果不同卵泡发育阶段MiRNA-315表达水平差异均有统计学意义（P<0.05）；不同卵泡发育阶段颗粒细胞凋亡水平差异有统计学意义（P<0.05）；和Mimics-351组增殖效能相比较，Inhibitor-351水平远远降低，两组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论MiRNA-351在小鼠卵泡发育各个过程中可能均有参与，且对增殖和凋亡水平均有调控作用，值得进一步深入探究。

[关键词]MiRNA-351；小鼠；卵泡发育；调控作用

雌性哺乳动物生殖过程十分复杂，并且呈现动态性周期变化。在卵巢生长发育过程中，卵母细胞生长、成熟、受精以及着床等均是维持正常妊娠必不可少的过程，而卵泡是卵巢生殖功能最为重要的部分，承担着生命繁衍的重要使命。近年来随着对人类生殖功能研究不断深入，人们对微小RNA在卵泡发育过程中作用认识也不断深入。据相关研究报道，MiRNA-351作为一种重要的调控因子，在细胞凋亡、增殖、分化等生理过程中均起着重要参与作用。为进一步探究MiRNA-351在卵泡发育中的调控作用，本研究特以小鼠模型为对象开展实验探究，旨在为卵泡发育机制研究提供理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料

选取60只雌性小白鼠作为研究对象，均购自南京大学实验动物中心，品系为C57 black 6，批号为000659。室温条件下，12h光照、12h黑暗下饲养，自由采食和饮水，并严格控制温度、湿度、光照条件。入选标准：（1）健康雌性白鼠；（2）经我院实验动物伦理审查。排除标准：（1）未足月分娩幼鼠；（2）卵巢先天畸形，或发育异常。

1.2方法

1.2.1所有幼鼠均注射PMSG和HCG，剂量均为10IU，并于出生后第5、7、11、14天和第20天处死（每次处死12只），在显微镜下分离出小腔前卵泡（直径100～130μm），大腔前卵泡（直径200～280μm），有腔卵泡（直径450～550μm）和成熟卵泡（直径500～600μm），各15只。

仪器：切片机（德国Leica RM2135型）；移液器（美国Thermo Finnpipette型）；显微镜（日本Nikon 80i型）；微波炉（中国GalanzP7021TP-6型）；恒温箱（中国福马GHX-9270B-1型）；恒温冰箱（中国荣事达BCD-245F）。

1.2.2主要试剂和设备（1）试剂：异丙醇、无水乙醇、β-强基乙醇、氯仿、氯化钾、磷酸氢二钠等均从我院实验室领取；a-MEM培养液、胎牛血清、双抗、胰酶等均购自美国Gibco公司、mRNA分离试剂盒购自美国Qiagen公司；（2）细胞培养皿和培养板购自美国康宁公司，恒温水浴锅（杭州朗越仪器HH-501型）、酶标仪（北京普朗新9602A型）、高压灭菌锅（济南展康BKQP-75L型）、工作台由我院实验室提供、离心机（德国HERML Eppendorf 5418型）、电泳仪（美国Bio-rad 164-5070型）、超低温冰箱（中国荣事达BCD-245F）、培养箱（中国福马GHX-9270B-1型）、荧光显微镜（日本Nikon 80i型）等；（3）缓冲液配置：PBS、细胞培养液、卵泡成熟培养液以及卵泡分离液等均参照《现代实验动物学技术》中相关方法配置。

1.2.3实验方法参照《现代实验动物学技术》依次行引物设计、卵泡MiRNA提取、颗粒细胞分离和体外培养、颗粒细胞转染MiRNA、颗粒细胞凋亡和增殖水平检测等，（1）引物设计（由大连宝生物技术有限公司设计合成）；（2）卵泡MiRNA提取：首先行样品处理，然后采用PBS缓冲液行裂解处理，将已反转录好的模板行RT-PCR反应，反应程序：95℃条件下预变性（时间为5min）、95℃条件下变性（时间为10s），60℃条件下退火（时间为30s），共进行40个循环后持续缓慢升温至95℃，自然冷却。结果分析：利用扩增倍数公式，重复三次计算样品中MiRNA-351表达量；（3）颗粒细胞分离和体外培养：使用胰酶、培养液等进行颗粒细胞分离、体外培养和传代；（4）颗粒细胞转染MiRNA：转染前应首先行接种处理，然后将细胞置于培养基孔中，摇匀后在培养箱中37℃条件下孵育，注意需要每隔4～6h更换一次培养基；（5）颗粒细胞凋亡和增殖水平检测：分别采用流式细胞仪和酶标仪对上述转染后的细胞进行凋亡和增殖水平检测，检测前需要将颗粒细胞进行PBS缓冲液冲洗，离心分离。

1.3观察指标

观察不同卵泡发育阶段MiRNA-315表达水平，共分为小腔前卵泡、大腔前卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡等；对比MiRNA-315对颗粒细胞凋亡和增殖水平的影响。

1.4统计学分析

采用SPSS17.0国际专用统计学软件处理数据，表达水平、增殖效能等计量资料均用（x±s）的形式描述，多样本比较用方差分析，两两比较用SNK-q检验。当P<0.05时，认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1不同卵泡发育阶段MiRNA-315表达

不同卵泡发育阶段MiRNA-315表达水平差异均有统计学意义（P<0.05），其中以大腔前卵泡MiRNA-315表达水平最高，小腔前卵泡、有腔卵泡次之、成熟卵泡最低，详情见表1。

2.2MiRNA-315对颗粒细胞凋亡水平的影响

不同卵泡发育阶段颗粒细胞凋亡水平差异有统计学意义（P<0.05），其中有腔卵泡凋亡水平最高、小腔前和成熟卵泡次之、大腔前卵泡最低，详情见表2。

2.3MiRNA-315对颗粒细胞增殖水平的影响

和Mimics-351组增殖效能相比较，Inhibitor-351水平远远降低，两组间差异有统计学意义（P<0.05），详情见表3。

3讨论

雌性哺乳动物刚出生时卵巢内便存在有大量的卵泡，此类原始卵泡将会随着时间的延长和卵泡池的建立逐渐开始启动生长、凋亡等一系列生理过程。原始卵泡同时也会随着时间的延长和年龄的增长不断消亡耗竭，只有极少数能够发育至成熟。而另外巨大部分卵泡由于GCs的凋亡在发育过程中出现闭锁。GCs凋亡在卵泡发育过程中的调控作用已在小鼠模型中得到验证，并且随着研究不断深入，相关抗凋亡因子和促凋亡因子及其作用也逐渐被挖掘明确。其中MiRNAs在不同出生天数，即不同卵巢发育程度时间表达谱中显示显著差异，并且在其它动物体外实验研究中得到证实。MiRNA-351作为其中较为重要的一份子，在小鼠卵泡发育过程中具有显著作用。

MiRNA-351具有多重功能，在前脂肪细胞及干细胞增殖、分化、凋亡及激素分泌调节中均具有显著作用。该因子水平过度表达将会导致相应细胞局部形态学方面变化，并且在卵巢卵泡细胞分化、转录和调控作用中均有参与。据国外相关研究资料表明，将小鼠中的MiRNA-351基因敲除，将会使得卵泡细胞增殖受抑，并且在分化向凋亡转换进程将会被明显缩短，且在MiRNA过表达小鼠卵巢中发现卵泡细胞发育进程也同样发生异常，在凋亡和增殖分化过程中也同样涉及MiRNA表达及调控作用。此外，MiRNA-351表达由于在小鼠卵泡发育过程中作用不同，故而其表达水平和调控机制也不相同，在特定阶段可能对复杂基因均有调控作用，从而影响其卵泡凋亡和增殖水平。MiRNA-351在不同生理发育过程和特定时间内才会表达，并参与复杂基因调控机制，从而促进卵泡生长发育。Mimics-351属于一种模拟酶，可通过抑制相关基因表达对卵泡细胞生长产生负向调控作用，同时还可抑制其增殖和生长，推测该因子可能通过降解相关基因mRNA以调控卵泡细胞发育状态；而Inhibitor-351为MiRNA-351基因受体，主要通过翻译抑制和蛋白质调控途径发挥作用，从而控制卵泡发育和闭锁平衡。当前，关于MiRNA-351对小鼠卵泡发育中调控作用机制认识尚不够深入，但是对于Mimics-351和Inhibitor-351二者在卵泡发育中异常表达已得到一致肯定，将为雌性动物卵巢中卵泡生长机制发育和病理改变研究提供奠定基石。

本研究结果中，不同卵泡发育程度MiRNA-315表达水平存在显著差异，且MiRNA-315对颗粒细胞凋亡和增殖水平的影响也显而易见，推测该因子表达水平和小鼠卵泡发育程度、细胞增殖和凋亡作用及机制均有显著调控作用。综上，MiRNA-315可能参与小鼠卵泡发育过程内在调控，在一系列生理改变过程中均有明显作用。但是本研究仍存在不足：目前Mimics-351和Inhibitor-351具体作用机制尚不明确，且MiRNA-315和卵巢卵泡细胞病理改变临床关系仍需要进一步研究探索，而随着分子生物学发展不断深入，上述问题将会成为今后研究重点和发展方向。