麦秸秆菌丝体饲料化生产的真菌品种筛选

侯立娟++丁成龙++林金盛++宋金俤++曲绍轩++李辉平++蒋宁++李凤玉++马林

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.129

摘要：为解决秸秆饲料化转化中消化率低的难题，开发秸秆分解与软化技术，优先分解纤维素和半纤维素，促进秸秆资源的饲料化利用与推广，以真菌菌株为中间载体，以小麦秸秆为原料，将秸秆转化为菌丝体饲料，并进行秸秆饲料化规模生产的效果评价研究。以显色反应和生长速度为指标进行菌株初筛，筛选发菌生长速度快并且适合规模化生产菌丝体饲料的菌株，并进一步对其营养成分进行动态监测，筛选降解纤维素和半纤维素能力强的菌株，为菌丝体饲料规模化生产奠定基础。结果表明，红平菇具有较强的生长速度，在Bavendamm平板上和RB亮蓝平板上生长速度最快，分别在6 d和9 d长满平板，红平菇对麦秸的纤维素降解率高达54.8%，粗蛋白降解率高达86.58%，以红平菇开发的菌丝体饲料具有较好的应用效果。

关键词：麦草；红平菇；降解；菌丝体蛋白

中图分类号： S816.5+3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0448-03

收稿日期：2015-12-03

基金项目：2015年江苏省“博士-企业集聚计划”项目；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（13）5012、CX（12）1002]；江苏省自然科学基金青年基金（编号：BK20140742）；现代农业产业技术体系建设专项资金（编号：CARS24）。

作者简介：侯立娟（1981—），女，吉林松原人，博士，副研究员，从事食用菌栽培和菌糠综合利用研究。E-mail：mybailinggu@126.com。我国年产各类秸秆约9亿t，除部分机械还田外，大部分被焚烧，用作饲料的不足10%，秸秆利用率不高，国家和地方政府开始重视秸秆的综合利用[1]。秸秆作为农作物的主要副产品，是一种重要的可再生资源，秸秆综合利用中，将秸秆转化为反刍动物可利用饲料具有较高价值。随着我国畜牧业的发展，畜牧饲料所需粗蛋白缺口庞大，开发高品质的秸秆饲料具有极广阔的市场前景。 本试验采用室内分析和室外栽培相结合的方法，选出8种适合用小麦秸秆栽培的不同菌株为试验材料，采用Bavendamm显色、RB亮蓝显色反应进行初筛降解木质纤维素能力强的菌株，再结合室外栽培试验，缩小并锁定优良菌株，通过营养成分分析和降解指标确定在小麦秸秆上具有高效降解木质纤维素的专一品种，为开发秸秆饲料奠定理论基础，同时为麦草资源化利用提供有效途径。

1材料与方法

1.1菌株

适合小麦秸秆生料栽培的菌株共8个，包括红平菇、杂3、苏5、鸡腿1号、鸡腿2号、棕蘑、双孢蘑菇W2000和W192。均由江苏省农业科学院蔬菜研究所食用菌项目组提供。

1.2栽培配方

栽培基质组成为：80%小麦秸秆、10%饼肥和10%麸皮。

1.3试验方法

1.3.1菌株培养方法

1.3.1.1菌种活化供试菌株在PDA培养基的斜面上接种进行活化培养。被活化了的菌种再接种于PDA培养基平板上，25 ℃培养，7 d后备用。

1.3.1.2菌丝的显色试验（1）PDA-Bavendamm 显色试验（漆酶鉴定培养基）：在纯培养中，加入0.4 mmol/L的鞣酸，pH值5.5，用打孔器制成菌塞，定量接种于平板上，25 ℃条件下培养。记录菌落周围有无褐色轮环产生及显色程度，有褐色轮环者记为“+”，反之记为“-”，并记录显色时间和显色程度[2]。（2）PDA-RB亮蓝显色法（过氧化物酶鉴定培养基）：将625 mg/L RB 亮蓝单独灭菌后，在无菌条件下，与PDA 培养基混匀，制成PDA-RB 亮蓝平板，接种后25 ℃培养，观察记录平板上有无黄色轮环产生，有黄色轮环记为“+”，反之记为“-”，并记录显色时间和显色程度[3]。

1.3.1.3菌丝生长速度测量方法用打孔器在PDA培养基上打孔，然后将菌饼接种在70 mm的PDA 培养基上，接种 1～2 d菌丝已经定植并正常生长时，以菌饼为中心，沿菌丝生长的前沿划“十”字线，2条线之间的距离与时间之比即为菌丝生长速度（mm/d）。

1.4培养料建堆发酵

按照“1.2”节介绍的配方进行备料，小麦秸秆必须新鲜、无霉、无虫。将小麦秸秆铡成长5～8 cm，饼肥进行粉碎后备用。将小麦秸秆用1%石灰水预湿4 d，尽量让培养料浸透水分。按照1层小麦秸秆、1层麸皮、1层饼肥的顺序在日光温室进行建堆，建堆高度约1.5 m，堆宽约1.6 m，长度依场地和培养料总量而定。培养料的水分控制在65 %左右，可边建堆边淋水。建堆完毕和每次翻堆后都要打孔通气，可以在料堆的两侧或上部进行打孔，以利通气好氧发酵。

建堆后观察料温，达到65 ℃进行第1次翻堆，将培养料上下、内外颠倒。料温再次升到60 ℃时第2次和第3次翻堆，建堆的时间随着季节、气温的高低和培养料的多少等灵活掌握，如果气温过低，可在料堆上覆盖1层薄膜。一般翻堆5～7次，堆料时间约30 d。发酵好的料呈深棕色，含水量在65%左右，pH值为 7或略高。在料中外层出现灰白色的高温放线菌，培养料不黏手且有弹性，小麦秸秆有一定的拉力，说明发酵正常。

1.5装袋、接种

栽培用的出菇袋根据生产季节选用宽17、20 cm或 22 cm 的聚乙烯料袋，袋厚度为2.5～5 μm，袋长40～50 cm，在夏季或早秋进行打包生产时，由于温度较高，一般选用较小口径的袋子，防止内部温度不易散发造成菌丝受高温而“烧”死。装袋的同时进行接种，菌种扒成玉米粒到豌豆粒大小，装袋时先在筒袋中加入1层菌种，装入约1/3袋高的培养料，播入第2层菌种，然后再装入约1/3袋高的培养料，播入第3层菌种，然后将培养料装满袋，播入第4层菌种，播种量约为15%，袋口用扎绳扎上，在菌袋外侧接种层的部位用缝衣针转圈刺20个左右的孔，以利排热和散气。

1.6菌丝培养

接过种的菌袋，有条件的放置于整洁、通风、干燥的培养室中培养，发菌环境20～25 ℃。温度较高时及时通风降温，经常检查菌袋，防止袋内温度超过33 ℃烧死菌种，温度超过30 ℃时要及时疏散袋子使之尽快散热降温。发现有污染菌袋应及时将其清除，一般30 d左右菌丝发满，不同菌株的生长特性不同，发菌速度也不同。

1.7营养成分的测定

培养料按照固定配方配制后，在堆料过程中取样，本次试验在堆料后0 d，在培养料堆料后13 d以及在不同菌株发满菌丝后取样，分别测定培养料不同阶段的干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、碳、氮、磷及钙含量。样品营养成分分析均由江苏省农业科学研究院食品质量安全与检测研究所完成。

2结果与分析

2.1PDA-Bavendamm和RB亮蓝平板显色反应

Bavendamm平板显色反应是判断微生物是否能分泌漆酶并降解木质素的一种方法，其原理是：菌株如果能产该酶，则会与培养基中的酚类化合物起反应，菌落的周围会形成棕褐色轮环，呈现阳性反应[2]。

RB亮蓝平板变色反应用来判断微生物是否能分泌过氧化物酶并降解木质素的原理是：菌株如果能产该酶，则会与RB亮蓝反应，使得RB亮蓝转变成橙黄色，呈现阳性反应[3]。

本试验中对8个供势菌株进一步通过2种显色反应比较结果见表1。通过观察可以看出，8个菌株在Bavendamm显色反应和RB显色反应中，均能呈现显色反应，说明各菌株都具有产生漆酶和过氧化物酶的能力，但是不同菌株之间在显色时间及显色程度上差异显著。

在PDA-Bavendamm平板（1号培养基）上，同样是侧耳类，红平菇的菌株显色反应最快，5 d时已经呈现明显的显色圈，随后颜色逐渐加深，其次是苏5和杂3。双孢蘑菇类在 5 d 开始显色，随后颜色随之加深；鸡腿菇类在7 d时开始显色。 在RB显色和W2000平板上（2号培养基），棕蘑直到 10 d 才开始显色，鸡腿菇3号和W2000在5 d开始显色，其他菌株在3 d均已开始显色，尤其是红平菇、苏5和鸡腿菇2号的显色圈的颜色加深相对比较快。因此，可以说明平菇类的3个菌株的漆酶和过氧化物酶活性较强，可以初步判定，这3个菌株是可以用作降解小麦秸秆的优势菌株。

2.2不同菌株生长量的测定

菌株生长量的高低用其在PDA固体培养基上的菌丝生长速度来表示，而菌丝生长速度的测定常采用菌落直径测定法[4]，通过测定菌落在基础培养基上的直径确定不同菌株的生长速度，8个菌株在25 ℃条件下培养，跟据不同菌株在2种显色平板上的生长速度进行定期测定（3 d或5 d），以其中多数菌株长满平板的时间为最终测量周期。

通过在2种培养基上的菌落直径确定8个菌株的生长速度，所有菌株均在10月22日接种在直径为7 cm的平皿中，分别接种在2种培养基上，各处理5次重复。各菌株在25 ℃ 培养箱中培养，记录8个菌株菌丝长满平皿的时间。结果发现8个菌株在2种培养基上的生长速度不同，即使同一培养基上，8个菌株的生长速度也不同。

由表2可以看出，在PDA-Bavendamm培养基上，不同菌株的生长速度不同，以平菇类的菌丝生长速度为最快，其次是鸡腿菇类，双孢蘑菇类的菌丝生长速度最慢。从菌丝的生长速度上比较，红平菇菌株生长速度最快，在接种后6 d就已长满这个平板，其生长速度平均为11.67 mm/d，其次是苏5，接种后8 d长满平板，其平均生长速度为8.5 mm/d，然后是菌株杂3在 10 d 长满平板，其平均生长速度为7 mm/d；鸡腿菇2号需要13 d长满平板，鸡腿菇3号需要24 d长满平板。直到检测到24 d时，3个双孢蘑菇的菌丝都未长满平板，以棕蘑菌株生长速度相对较快。生长速度较快的菌株能在短时间内获得大量菌丝体生物量，而大量的菌丝体生物量是产酶的物质基础。因此，选择一定时间内生物量高的菌株是筛选高效菌株的重要措施之一。本试验证明红平菇菌株生长速度最快，说明菌丝体生物量最大，产酶活性越高的红平菇相应降解木质素的能力越强，所以红平菇菌株降解能力最强；鸡腿菇类的菌株比双孢蘑菇类的菌株降解木质纤维素能力强。

不同菌株在PDA-RB培养基上的生长速度见表3。不同的菌株在2号培养基上的生长速度表现不同，接种9 d测量菌丝的生长速度时，平菇类的3个菌株均已长满平板，相同时间点测量菌丝的生长速度，还是以红平菇的生长速度最快。其次是鸡腿菇2号，12 d长满平板，鸡腿菇3号，16 d长满平板，双孢蘑菇类的3个菌株生长速度较慢。

2.3不同处理物料的营养成分比较

将筛选出来的红平菇、棕蘑及鸡腿菇2号3个菌株接种在相同的小麦秸秆基质上，分别于建堆的0 d、13 d及不同菌株接种后直至菌丝发满菌袋的时间测定干物质、粗蛋白、粗脂肪、碳含量、氮含量及微量元素磷和钙的含量。

由表4可见，干物质随着发菌时间的延长，不同菌株均呈增加的趋势，鸡腿菇2号、棕蘑、红平菇的发满菌丝期比初始建堆期的干物质分别增加1.36%、0.45%、2.48%；粗蛋白的含量呈增加趋势，与初始建堆期相比，鸡腿菇2号、棕蘑、红平菇蛋白的含量分别增加32.24%、88.85%、86.58%，各菌株粗蛋白的含量与初始值相比，均达到了1%显著水平，以红平菇和棕蘑的含量相对较高。

粗脂肪的变化，只有红平菇呈增加趋势，增加16.36%，其他2个品种呈下降趋势，鸡腿菇2号下降52.73%；棕蘑下降13.33%。各菌株粗纤维随着发菌期的延长呈降解加快的趋势，鸡腿菇2号、棕蘑、红平菇发满菌丝后对粗纤维的降解率分别达到58.36%、53.38%、54.80%，3个菌株的粗脂肪和粗纤维含量的变化均达到了1%显著水平，其中均以红平菇>棕蘑>鸡腿菇为变化趋势。

微量元素P和 Ca含量随着发菌期的延长呈增加趋势，不同的菌株增加的幅度不同，棕蘑P 含量增加最多并达到了1%显著水平，增加达181.42%；其次是红平菇，增加达14427%，鸡腿菇2号P的含量增加最少，为82.21%；Ca含量以鸡腿菇2号增加最多，与其他2个处理比较，达到了1%显著水平，增加达64.67%；其次是棕蘑，增加46.11%，相对较少的是红平菇，增加27.54%。

随着菌丝发菌时间的延长，C含量呈现大幅度被降解利用的趋势，N含量呈现增加的趋势，不同菌株增加或减少的幅度不同。红平菇对C 降解的幅度最大，达49.34%；棕蘑和鸡腿菇2号降解的幅度相近，分别为 34.44% 和34.37%；N含量的增加以棕蘑、红平菇、鸡腿菇2号依次递减，分别增加90.00%、87.86%、35.00%。

3讨论

栽培食用菌的菌糠常以棉籽壳、锯木屑、稻草、麦秸、玉米芯、甘蔗渣等多种农作物秸秆及工业废物为主要原料。菌糠粗蛋白含量明显提高，粗纤维含量显著下降，不仅可以变废为宝，促进资源的再次利用，而且可以降低饲料成本，提高经济效益[5]。目前有关食用菌栽培后的菌渣在养殖业中的应用已有大量报道，如作为奶牛、肉兔、鹅、肉鸡、猪等饲料，具有降低饲料成本、提高经济效益的作用[6]，本研究仅从菌丝体饲料化的角度，以提高麦秸秆的营养和适口性为主要目的，通过筛选适合生产菌丝体饲料的菌株，以真菌菌株为中间载体，将秸秆转化为菌丝体饲料，极大地提高了秸秆粗蛋白的含量和

秸秆纤维的转化率，是畜禽生产中重要的蛋白来源。

不同的食用菌品种，选择栽培原料成分不同，其菌糠的营养价值也会有所不同。不同的食用菌品种在相同的栽培基质上，其菌糠的营养成分也会不同[7]，因此本研究原料的成分只有小麦秸秆、麸皮及饼肥，既可以满足选定食用菌品种的生长，其菌糠也能满足羊等反刍动物的营养需求。通过不同品种不同生长阶段对其营养成分的动态监测，红平菇不仅发菌速度较快，而且粗纤维被分解多，粗蛋白和粗脂肪含量高，而本试验的菌丝体饲料是到长满菌丝的阶段为止，并未让其出菇，营养价值保留在培养基质中，并未进一步转化，所以从理论上与出菇后的菌糠成分相比，菌丝体阶段的营养成分会相对较高，更适合于用作反刍动物的饲料。

食用菌培养基经过菌丝体的生物固氮和酶解作用等一系列生物转化过程后，其中的纤维素、半纤维素和木质素等物质均被不同程度地降解，而粗蛋白和粗脂肪的含量则有所提高，且富含氨基酸、多糖及钙、磷、铁、锌等多种矿物元素，同时还可产生有机酸和生物活性物质等，这就增加了菌糠中营养成分的含量，并增强了菌糠的菌香味，从而有利于提高菌糠的适口性和消化率[5]。本试验的结果与前人报道的结果相似。下一步的试验，是将菌丝体饲料开展饲喂试验，证实饲喂效果，并进一步采用发酵隧道技术规模化生产菌丝体饲料，并根据菌株和秸秆类型，制定标准化菌丝体饲料的关键技术规程，按照订单式生产菌丝体饲料，充分提高秸秆饲料化价值，对我国畜牧业的可持续发展具有重要的现实意义。

参考文献：

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