苏姜猪RPL10a假基因第2外显子多态性与产仔数的相关性

张伟++陈章言++王利红+++仝蒙

摘要：为深入探讨猪核糖体蛋白L10a假基因（RPL10a pseudogene）的多态性及其与产仔数性状间的相关性，采用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）检测方法，分析苏姜猪RPL10a假基因第2个外显子区的多态性。检测结果显示：引物P1扩增区存在AA和AB等2种基因型，引物P4扩增区存在4种SSCP型；经核酸序列比对分析发现，在27 389 415、27 389 835、27 389 946位分别存在C→G、G→A、A→G的突变，27 389 851位为碱基A的插入突变。经群体遗传学分析，各基因分布符合哈迪-温伯格定律，处于群体平衡状态。将各基因型与苏姜猪5个胎次的平均产仔数进行相关性统计分析，结果表明，RPL10a假基因引物P1和P4各扩增区不同SSCP类型与苏姜猪平均产仔数性状间无显著差异（P>0.05）。将2个扩增区不同SSCP型综合分析，结果显示，同时存在AB型与SSCP-1型苏姜猪的第1胎平均产仔数显著高于同时具有AA型与SSCP-1、SSCP-2型的苏姜猪（P<0.05）。

关键词：苏姜猪；RPL10a假基因；PCR-SSCP；产仔数

中图分类号：S828.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0062-04

收稿日期：2016-02-23

基金项目：江苏省科技支撑计划（编号：BE2014381）；江苏农牧科技职业学院院级课题（编号：NSFPT201505）。

作者简介：张伟（1973—），男，高级畜牧师，主要从事动物遗传繁育研究。E-mail：hdjgzhangwei001@163.com。核糖体是所有生物细胞中合成蛋白质的重要细胞器，由蛋白质和RNA组成。真核生物的核糖体约有80种核糖体蛋白亚基[1]，分为大亚基和小亚基。大亚基（60S）核糖体蛋白命名为L1-L44，小亚基（40S）核糖体蛋白命名为S1-S31[2-3]。核糖体蛋白L10a（ribosomal protein L10a，RPL10a）即属于核糖体60S大亚基的蛋白[4]。核糖体蛋白的功能较多，不仅在蛋白质的合成中发挥作用，还参与复制、转录、RNA加工、DNA修复等过程，在细胞增殖、凋亡、发育的多种调控和恶性转化等方面也发挥着重要作用[2]。随着生物基因组研究的不断深入，现已发现多种生物存在假基因，即所谓的“垃圾”DNA，其中包括很多看家基因，如肌动蛋白、微管蛋白、金属硫蛋白、免疫球蛋白、核糖体等。这些假基因可通过DNA调控或RNA调控方式，调节同源功能基因的表达、蛋白翻译、基因沉默等[5]。目前，对假基因的检测分析已成为生物进化及基因调控研究的新热点。本研究首次检测分析位于10号染色体的猪RPL10a假基因第2外显子的多态性，并分析其与产仔数生产性状间的相关性，为深入探讨猪RPL10a假基因的功能、扩展猪分子辅助选育研究提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

随机选取50头苏姜猪母猪，剪取耳组织，采用酚-三氯甲烷抽提法提取组织中的DNA，用超纯水稀释至100 ng/μL，于 -20 ℃ 下保存备用。

1.2引物设计与PCR扩增

根据GenBank数据库中猪RPL10a假基因NC_010452.3第2个Exon的核酸信息，采用Primer premiers 5.0软件设计4对引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3PCR-SSCP分析

样本DNA扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54～56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR扩增后，将产物进行变性处理，采用12%非变性聚丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺（29 ∶1）凝胶电泳 8～12 h，银染显带并拍照分析，将不同基因型PCR产物送至上海基康生物技术有限公司测序。

1.4统计分析

采用SPSS 13.0软件对试验数据进行差异显著性检验分析。

2结果与分析

2.1RPL10a假基因第2外显子与RPL10a功能基因序列相似度分析

采用GenBank网站的BLAST软件比对分析RPL10a假基因第2外显子与RPL10a功能基因核酸序列（表2）。结果显示，RPL10a假基因有5处核酸序列区段与功能基因的5个外显子相似（RPL10a基因有6个外显子），且相似度较高，表明RPL10a假基因第2外显子区可作为分析假基因调控功能基因表达的主要区段。

2.2引物P1～P4 PCR扩增结果

将RPL10a假基因4对引物PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳（图1）检测，电泳条带清晰，表明引物P1～P4 PCR扩增特异性好。将PCR扩增产物测序后，进行NCBI数据库BLAST分析，结果显示，所扩增序列与猪（Sus scrofa）RPL10a假基因第2个外显子序列有高度相似性，分别为98%、99%、99%、98%，表明本试验扩增的核酸序列位于所检测基因区。

2.3PCR-SSCP分析结果

将RPL10a假基因PCR扩增产物经SSCP分析，结果显示，引物P1扩增产物存在2种SSCP条带类型，分别为AA型和AB型（图2）；引物P2、P3扩增产物不存在单链构象多态性（图3）；引物P4扩增产物存在4种SSCP条带类型（图4）。

2.4引物P1、P4扩增产物不同基因型序列分析

引物P1的不同PCR-SSCP样本经核酸序列测定并与NC_010452.3比对分析，结果显示，在27 389 415位存在 C→G 的突变（图5）。

将引物P4的不同PCR-SSCP样本经核酸序列测定并与NC_010452.3比对分析，结果显示，在27 389 835、27 389 946位分别存在G→A、A→G的突变，27 389 851位存在碱基A的插入（图6）。

2.5苏姜猪RPL10a假基因群体遗传分析

苏姜猪RPL10a假基因引物P1、P4扩增区不同SSCP型频率以及基因频率见表3、表4。由表3可知，引物P4扩增区SSCP-1型所占比例最高，为50%，SSCP-4个体数最少，仅占6%；由表4可知，27 389 415、27 389 835、27 389 946碱基突变位点均为野生纯合型高于杂合型，但均未在苏姜猪群体中检测到突变纯合型。根据哈迪-温伯格定律，经卡方检验各基因群体平衡性（表5），结果表明，2对引物扩增区在 27 389 415、27 389 835、27 389 946位点的碱基突变均未达到统计学差异显著级别（P>0.05），表明各基因分布符合哈迪-温伯格定律，处于群体平衡状态。

2.6苏姜猪RPL10a假基因不同SSCP型与产仔数间的相关性分析

对有产仔数生产记录的苏姜猪进行5个胎次的平均产仔数统计分析，结果（表6、表7）表明，RPL10a假基因引物P1、P4扩增区不同SSCP类型的平均产仔数性状间无显著差异（P>0.05）。综合分析引物P1、P4扩增区不同SSCP类型，结果（表8）表明，同时存在AB型与SSCP-1型的苏姜猪第1胎平均产仔数显著高于同时具有AA型与SSCP-1、SSCP-2型的苏姜猪（P<0.05），其他类型的各胎次平均产仔数无显著差异（P>0.05）。

3结论与讨论

随着现代生物科技的快速发展，现已通过基因组测序和转录过程中mRNA反转录为cDNA，然后以cDNA的方式重新整合进入基因组，在生物长期进化选择过程中由于随机突变积累而丧失功能[5]。本研究通过PCR-SSCP 方法检测到

引物扩增区突变位点（位）χ2值P127 389 4152.75P427 389 8350.2027 389 9465.56注：“*”表示在0.05水平下差异显著，未标注者为差异不显著（P>0.05）；χ2（2，0.05）=5.99。

基因克隆鉴定技术发现生物体基因组中存在大量的假基因，如人类基因组中约97%为非表达序列，即所谓的“垃圾”DNA[5]。假基因的产生主要有2种类型，一种是正常基因的复制或基因之间的不平衡交换，产生点突变、插入、缺失、移码突变等，导致复制后的基因无法进行正常编码；另一种类型是苏姜猪群体中RPL10a假基因第2个外显子区存在多态性，经序列比对，在27 389 415、27 389 835、27 389 946位点存在C→G、G→A、A→G碱基突变，在27 389 851位点检测到碱基表6引物P1不同PCR-SSCP类型苏姜猪各胎次平均产仔数

SSCP类型各胎次平均产仔数（头）第1胎第2胎第3胎第4胎第5胎AA9.47±2.91（30）11.21±2.92（28）9.94±1.98（17）11.29±2.31（17）11.69±2.72（13）AB11.61±2.71（18）11.22±2.37（18）10.71±2.46（14）11.00±2.31（13）11.64±2.37（14）注：同一胎次不同SSCP类型间，数据后未标字母和字母相同者表示在0.05水平下差异无统计学意义，字母不同者表示在0.05水平下差异显著。下表同。

A的插入突变，表明猪RPL10a假基因的产生符合假基因产生的第1种类型。通过群体遗传学分析突变位点各基因频率的平衡性，发现各基因频率均符合哈迪-温伯格定律，表明这些基因在苏姜猪群体中已处于群体平衡状态。

2003年，日本研究小组发现第1个有功能的假基因，并培育出插入makorin1基因的变异体，即makorin1-p1的假基因（致死基因）小鼠；该假基因不编码蛋白质，但当其损坏后对应的真基因也不工作，最终导致小鼠死亡[6]，表明假基因表7引物P4不同PCR-SSCP类型苏姜猪各胎次平均产仔数

表8同。

在生物体内具有重要的调控机能。此后，有关假基因的研究报道进一步证实，假基因的作用具有序列专一性，只影响与基因本身相似的序列，通过DNA和RNA指导调控功能基因的表达，参与基因沉默、催化、发育调控等[5]。RPL10a基因表达核糖体60S大亚基上的蛋白，不仅在蛋白质合成中发挥重要作用，还参与调控基因的转录、翻译，调控细胞增殖、凋亡、分化等。已有研究报道，RPL10a蛋白基因突变与自闭症的发病机制有关[7-8]。猪RPL10a基因位于第10号染色体，有6个外显子，而RPL10a假基因位于第7号染色体，有2个外显子。通过比对功能基因和假基因第2外显子核酸序列，发现有5个相似区均位于功能基因的外显子区，表明RPL10a假基因可能参与功能基因的表达调控过程。本研究检测出的苏姜猪RPL10a假基因27 389 415、27 389 835位点的突变，对应于功能基因第1、第4外显子区内，但在苏姜猪群体中均未检测到突变纯合型，表明RPL10a假基因上述突变位点的突变纯合型可能会影响功能基因的表达，进而导致个体生理功能异常，使胚胎早期死亡。27 389 946、27 389 851位点均不对应于功能基因的外显子区，虽然27 389 851位点为碱基插入突变，可能不会影响功能基因的表达，但具体的调节机制有待后续研究。

为深入研究假基因的功能，近年来，通过SSCP方法开展假基因多态性与生物性状间相关性的研究也逐步增加，如杨爱初等对多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶假基因多态性与苯中毒的相关性进行了研究[9]，以及唐录英等对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶假基因多态性分布及其与肺癌易感性关系进行了研究等[10]。本研究将PCR-SSCP方法检测获得的苏姜猪RPL10a假基因第2外显子区多态性与产仔数生产性状进行相关分析，结果显示，不同SSCP型同一胎次平均产仔数间差异不显著（P>0.05）。以苏姜猪个体为对象，将引物P1和P2不同SSCP多态性进行综合分析，在检测出的6头 SSCP-3型苏姜猪个体中无一兼具AA型，表明27 389 415位点的碱基突变与其他3个突变位点间可能存在一定影响，特别是27 389 835位点的突变影响可能较大；27 389 415、27 389 835 位点均对应于功能基因第1、第4外显子区内，表明与RPL10a功能基因外显子区相对应的假基因核酸序列上的碱基突变，对功能基因的表达可能存在影响。对各类型苏姜猪同一胎次平均产仔数间的差异显著性进行检验，结果表明，兼有AB型与SSCP-1型的苏姜猪第1胎平均产仔数[（12.30±1.70）头]显著高于兼有AA型与SSCP-1[（9.62±2.14）头]、SSCP-2型[（9.33±3.68）头]的苏姜猪（P<0.05），其他类型的各胎次平均产仔数间差异不显著（P>0.05）。可见，27 389 415位点碱基突变可能与其他位点的碱基变化具有协同作用，共同影响苏姜猪产仔数性状，但RPL10a假基因影响功能基因表达进而影响猪繁殖力性状的机制有待进一步深入研究。

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