苹果炭疽菌DNA改良提取法及PCR体系的优化

陈 汝,王金政,薛晓敏,王贵平

(山东省果树研究所,山东 泰安 271000)

苹果炭疽菌DNA改良提取法及PCR体系的优化

陈 汝,王金政*,薛晓敏,王贵平

(山东省果树研究所,山东 泰安 271000)

以苹果炭疽病胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)为试材,采用改良的SDS法、改良的CTAB法和改良的尿素法等对基因组DNA进行了提取和比较,并对ITS1-5.8S-ITS2区基因PCR扩增体系中模板的添加量以及退火温度进行了调整和优化。结果表明：采用这3种方法均能提取得到目的DNA,但采用改良的SDS法提取的基因组DNA产率最高、质量最好;当在25 μL PCR体系中添加0.75 μL粗提DNA 10倍稀释液以及退火温度设定为51 ℃时PCR产物的质量最高。

苹果炭疽病菌; DNA提取; PCR体系优化

近年来,炭疽菌属分类研究一直是国内外研究的热点,炭疽菌的准确鉴定对于炭疽病的流行研究及防控策略的制定意义重大。通常基于形态学的鉴定是不够准确的。近年来,随着分子生物学的发展, rDNA序列分析等分子生物学技术被广泛应用于炭疽菌的鉴定与分类研究[1-4]。胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)会引起苹果生长期和贮藏期侵染性病害的发生，造成苹果产量和品质的重大损失[5-7]。在分子生物学研究中,快速高效地提取质量优良的DNA是研究的基础。目前常用液氮研磨法、玻璃珠机械破壁法、酶解法、氯化苄法和尿素法等来溶解细胞壁[8-9]。笔者以苹果炭疽病胶孢炭疽菌为试材,改良并对比筛选出合适的DNA提取方法，得到了较高纯度和产量的全基因组DNA,可以满足后续的分子生物学实验的要求。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

苹果炭疽病胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides由本课题组提供,分离自红富士苹果果实。

1.2 病原菌菌丝的培养与预处理

将苹果炭疽病菌移至PDA平板上活化,在25 ℃下培养32～48 h；切取菌落边缘的菌丝块移至PDA平板,在25 ℃下培养,待菌丝长满培养皿时收集菌丝。将收集到的菌丝放入研钵中,加入液氮研磨成粉状,待用。

1.3 DNA提取方法

1.3.1 改良的SDS提取法[10]将研磨好的菌丝粉末置于已灭菌的1.5 mL的离心管内;加入100 μL SDS裂解液(含100 mmol/L Tris、30 mmol/L EDTA、1% SDS, pH 8.0,灭菌30 min);100 ℃水浴15 min;加入100 μL 2.5 mol/L的醋酸钾,冰上放置30 min;在4 ℃下以12000 r/min离心5 min,将上清液转移至新的1.5 mL离心管内;加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),剧烈振荡后,以12000 r/min离心15 min,将上清液转移至另一灭菌的1.5 mL的离心管内;加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1),剧烈振荡后,以12000 r/min离心15 min,将上清液转移至另一灭菌的0.5 mL的离心管内;加入等体积、冷的异丙醇,在-20 ℃下静置15 min;在4 ℃下以12000 r/min离心15 min;用100 μL 70%的乙醇洗沉淀;将沉淀自然晾干;加入50 μL已灭菌的ddH2O进行溶解;置于-20 ℃冷藏备用。3次重复。

1.3.2 改良的CTAB提取法[11-12]将研磨好的菌丝粉末置于已灭菌的1.5 mL的离心管内;加入300 μL 15×CTAB提取缓冲液[含0.7 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、20 mmol/L EDTA、10 g/L PVP-360、50 g/L CTAB),装管;65 ℃水浴1 h,每隔15 min振荡混匀1次；加入100 μL 2.5 mol/L的醋酸钾,冰上放置30 min;在4 ℃下以12000 r/min离心5 min;其他操作同改良的SDS提取法。3次重复。

1.3.3 改良的尿素提取法[13]将研磨好的菌丝粉末置于已灭菌的1.5 mL的离心管内;加入300 μL尿素提取液[含7 mol/L尿素、50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、62.5 mmol/L NaCl、1%SDS],65 ℃水浴1 h,每隔15 min振荡混匀1次；加入100 μL 2.5 mol/L的醋酸钾,冰上放置30 min;其他操作同改良的SDS提取法。3次重复。

1.4 ITS1-5.8S-ITS2区基因PCR扩增

以菌丝总DNA的10倍稀释液为模板,对ITS区进行扩增,以ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)[14]和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[15]为引物,这对引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。

25 μL PCR反应体系: 2.5 μL 10×PCR buffer (2.5 mmol/L,含Mg2+)、2.0 μL dNTPs (2.5 mmol/L)、0.5 μL ITS1 (10.0 μmol/L)、0.5 μL ITS4 (10.0 μmol/L)、0.75 μL或1.00 μL DNA模板、0.25 μL (5.0 U/μL)Taq 酶、17.5 μL或18.5 μL灭菌水。

PCR扩增反应在BIO-RAD S1000TM PCR扩增仪上进行。PCR反应条件如下:94 ℃ 5 min;94 ℃45 s,51 ℃或53 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃延伸10 min。

1.5 DNA凝胶电泳的检测

对提取的植物病原真菌DNA以及PCR扩增产物各取3 μL，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,用Gelstain荧光核酸染料染色。

2 结果与分析

2.1 DNA提取的电泳检测

由图1可以看出,改良的SDS法、改良的CTAB法以及改良的尿素法均能提取到大量的DNA。其中改良的SDS法提取的基因组DNA完整性较好,条带较窄,亮度较大,降解较少;改良的尿素法与改良的CTAB法提取到的基因组DNA完整性较差,条带较宽,稍有降解。

2.2 ITS1-5.8S-ITS2区PCR扩增的电泳检测

由图2可知,所有泳道的条带均为单一目的条带,均在500～700 bp之间,说明3种DNA提取方法均能满足PCR的质量要求。图2中数字编号为3种不同的DNA提取方法(1为改良的SDS法，2为改良的CTAB法，3为改良的尿素法)以DNA为模板PCR扩增所得的目的条带数,两次重复；大写字母编号表示不同的25 μL PCR反应体系和退火温度。在A编号的所有泳道中虽能得到目的条带,但条带亮度最暗,PCR结果最差。在C编号的所有泳道中虽能得到目的条带,但条带亮度参差不齐。在B编号的所有泳道中条带亮度最高,都很清晰整齐,PCR结果最好。说明以0.75 μL DNA为模板,退火温度为51 ℃时PCR效果最佳。

3 讨论与结论

丝状真菌基因组DNA的提取率和纯度对后续的PCR、酶切等实验有重要的影响[16-17]。丝状真菌DNA的提取方法虽已得到了改进和简化,但针对不同植物病原菌DNA的提取效果差异明显。目前,针对丝状真菌DNA的提取广泛采用的传统CTAB法是借鉴提取植物基因组的方法改进而来的[18]。改进后的CTAB法获得的基因组比率以及质量也较传统方法高。本文针对苹果炭疽病菌采用改良的SDS提取法,提取DNA的质量最好。在液体培养基中培养的菌丝的多糖含量高,在DNA提取、纯化过程中多糖残留量较大,若大量去除多糖则会增加DNA的损失[16]。因此本文采用PDA平板培养菌丝，再从这些菌丝中提取DNA,这样有效地减少了多糖对DNA的污染；此外,提取液中添加的SDS[19]、PVP[20]以及水浴之后用高浓度的醋酸钾溶液冰上沉淀[10]均能有效地去除多糖。

在PCR反应体系中,模板不是越多越好,可以通过倍比稀释法来确定合适的模板浓度;对于退火温度,过低时非特异性扩增增加,过高时产率会下降。本文将粗提的DNA溶解后再稀释10倍作为PCR扩增的模板,能有效地降低粗提DNA中酚类、多糖等的浓度,减少对PCR扩增的影响。此外,本实验对PCR反应体系中模板的添加量以及退火温度均进行了调整,得出当在25 μL PCR体系中添加0.75 μL粗提DNA 10倍稀释液以及退火温度设定为51 ℃时PCR产物的质量最高。

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(责任编辑:黄荣华)

Comparison of Several Modified DNA Extraction Methods andOptimization of PCR System forColletotrichumgloeosporioidesin Apple

CHEN Ru, WANG Jin-zheng*, XUE Xiao-min, WANG Gui-ping

(Shandong Institute of Pomology, Tai’an 271000, China)

The genomic DNA ofColletotrichumgloeosporioidesin apple was extracted and compared by modified SDS method, modified CTAB method and modified urea method, and the additive amount of template and the annealing temperature in the PCR system for the amplification of ITS1-5.8S-ITS2 gene were adjusted and optimized. The results showed that using the above three methods all could get the target DNA, but the yield of genomic DNA extracted by modified SDS method was the highest and its quality was the best. When 0.75 μL 10-fold dilution of the extracted crude DNA was added into 25 μL PCR system and the annealing temperature was set as 51 ℃, the quality of the PCR product was the highest.

Colletotrichumgloeosporioides; DNA extraction; Optimization of PCR system

2016-11-24

山东省自然科学基金项目(BS2015NY008);国家自然科学基金项目(31600021);国家重点研发计划(2016YFD0201100); 国家现代苹果产业技术体系项目(CARS-28);“十二五”农村领域国家科技计划课题(2014BAD16B02-2)。

陈汝(1985─),女,助理研究员,博士,从事果园微生物与栽培生理研究。*通讯作者:王金政。

S436.611.12

A

1001-8581(2017)04-0069-03