芝麻EMS诱变条件优化与突变体筛选

王慧丽，张海洋，马 琴，魏利斌，琚 铭，李 春，段迎辉，苗红梅

（河南省农业科学院芝麻研究中心，河南郑州450002）

芝麻EMS诱变条件优化与突变体筛选

王慧丽，张海洋，马 琴，魏利斌，琚 铭，李 春，段迎辉，苗红梅*

（河南省农业科学院芝麻研究中心，河南郑州450002）

为明确适于芝麻诱变的最佳甲基磺酸乙酯（EMS）剂量和处理时间，创制优异芝麻突变体，采用0.1%～2.0%EMS浸泡处理芝麻91-0株系种子6～24 h，研究了EMS不同剂量和处理时间对芝麻突变体创制效率的影响。结果显示，0.1%EMS浸种24 h、0.5%EMS浸种24 h、1.0%EMS浸种12 h、1.5%EMS浸种6 h处理芝麻种子发芽势、发芽率为53.13%～90.17%，根长为0.30～2.00 cm，活力指数为18.53～131.00，适于芝麻诱变研究。2008—2010年，选用1.0%EMS浸种12 h优化条件先后处理芝麻91-0株系成熟种子7万粒，共获得M1代植株22 855份，成株率达到32.65%。对诱变株系及其后代叶型、株型、花器与育性、蒴果及粒型以及其他共5类24个田间农艺性状的调查结果表明，M1、M2代诱变率分别为7.60%、2.78%，M1、M2代株系发生的主要突变性状类型均为花器与育性类，比率分别为4.08%、0.93%。对831份突变体后代株系的农艺性状调查结果显示，后代中可稳定遗传的突变体比率为23.71%，主要突变类型为蒴果及粒型，占总调查株系的14.80%。研究表明，在1.0%EMS浸泡12 h诱变处理条件下，芝麻91-0株系发生可遗传突变的比率为0.80%。

芝麻；甲基磺酸乙酯（EMS）；诱变；突变体库；频率

芝麻（Sesamum indicum L.，2n=26）属胡麻科胡麻属，是世界上最古老的油料作物之一［1-2］，也是我国重要的特色优质农产品。我国芝麻年种植面积45万hm2左右，居世界第4位，平均总产量为62万t，居世界第3位。2013年我国芝麻平均单产突破1 350 kg/hm2，居世界第1位，在世界芝麻生产和国际贸易中占有重要地位。但是，相对于粮食及其他油料作物，芝麻仍属于低产作物。除田间投入不足、管理技术低等因素外，收获指数低、籽粒成熟度不一致、抗病抗逆性差等是限制芝麻生产发展的主要因素［3-5］。因此，开展高产、稳产、适于机械化生产的新材料创制和新品种选育是当前国内外芝麻育种工作的重点。

甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS）化学诱变技术是当前创制作物优异新种质的一项重要技术手段。相对于转基因、远缘杂交等技术，EMS化学诱变技术操作简便，易形成点突变，且不易对染色体造成畸变，现已在水稻［6］、玉米［7］、油菜［8］、大豆［9-10］、番茄［11］等作物上广泛应用，对推动农作物功能基因组学和新品种选育研究起到了重要作用。近年来，国内外学者先后开展了芝麻EMS诱变研究［12-15］。Begum等［13］比较了0.5%～2.0%MES处理6 h对芝麻M3株系田间表型的影响，结果表明，0.5%EMS是芝麻最有效的诱变处理剂量。Kumar等［14］采用0.5%EMS处理芝麻，并观察了芝麻染色体异常和植株发育影响程度，认为0.5%EMS适于诱变芝麻。但目前尚未见有关大规模创制芝麻EMS突变体的报道。为此，以芝麻91-0株系为材料，系统比较了不同EMS剂量和处理时间对芝麻种子发育的影响，并对获得的大批EMS诱变株系进行了诱变频率和突变类型分析，为进一步推动芝麻种质遗传改良和新品种选育奠定技术和材料基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料：芝麻91-0株系，为芝麻基因组测序品种豫芝11号的多代自交纯化株系［16-17］，由河南省农业科学院芝麻研究中心保存。该品种为单秆型，株高约165 cm；叶色浓绿，中下部叶片为长椭圆形，有缺刻，上部叶片呈柳叶形；无限花序，每叶腋3花，花期35～40 d，花冠白色，授粉后花冠自然脱落；蒴果二心皮，蒴长3 cm左右，开裂正常；种子长卵圆形，种皮纯白色，千粒质量2.7～3.0 g，含油量56.38%，生育期80～85 d。EMS诱变剂购自美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 种子萌发处理与EMS诱变条件优化 挑选饱满健康的91-0株系种子，用清水冲洗种子表面后浸泡2 h。随后进行处理，即0.1%～2.0%EMS溶液（因素A）浸泡6～24 h（因素B），处理后用无菌水冲洗3次，吸水纸吸干种子表面水分后，将种子摆放在铺有2层滤纸的无菌培养皿内，25粒/皿，光照培养箱中培养。培养条件为温度25℃、光照14 h/d。每日加入适量无菌水，保证芝麻种子正常萌发。

为确定最适的EMS处理剂量及浸种时间，试验共设置15个处理，EMS质量分数（A1—A5）分别为0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，清水作对照（A6）。诱变时间（B1—B3）分别为6、12、24 h。每个处理设置4个重复，每个重复共处理籽粒100粒（4个培养皿）。每日调查种子发芽情况和根长至第7天，计算发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数。

发芽率=（第7天种子总发芽数/供试种子数）× 100%；发芽势=（第3天种子总发芽数/供试种子数）×100%；发芽指数=∑t日的发芽数/相应的发芽日数；活力指数=发芽指数×第7天根平均长度。

1.2.2 诱变M1代种植与观察 为构建芝麻EMS突变体库，2008—2010年，共处理91-0株系种子7万粒。5月下旬—6月上旬，将1.0%EMS浸泡12 h后的芝麻种子（M1）播于装有壤土的营养钵（8cm×8 cm）内，每钵种植4粒，覆膜确保种子萌发正常。3～4周后，将M1材料（2～3对真叶）移栽到试验田，常规田间管理。分别在苗期、现蕾期、初花期、盛花期及成熟期间调查植株田间性状变异情况。成熟后，按单株收获M1代种子。

1.2.3 诱变M2—M3代种植与观察 2009—2012年，随机挑选无性状变异的M1后代种子7 978份，按家系进行单行条播种植，行长5 m；适时进行间苗、定苗及常规田间管理，行距40 cm、株距20 cm。各生育期间及时记录变异表型特征、变异株数量及比例，并对每个突变表型特征拍照。成熟后，按株系分别收获各单株种子。

1.2.4 不育突变性状杂交保持 对M1或M2代出现的育性突变株，分别用邻近或同株行正常株进行姊妹交，同时选用91-0自交株系授粉杂交。第2年种植并调查育性性状分离比例，判定性状是否遗传。

1.3 田间农艺性状指标调查

田间调查的方法参照文献［18-19］，调查时期及性状指标包括：（1）苗期：叶色、叶型、茎杆颜色及茎杆茸毛量；（2）花期：每叶腋花数、花器形态、颜色、雌蕊数、雄蕊数及育性；（3）成熟期：株型、株高、节间长度、蒴果形态、蒴果长宽度、蒴果茸毛量、蒴果颜色、心皮数、裂蒴性、生育期长短及发育进程；（4）收获期：单蒴粒数、千粒质量、种皮色。

EMS诱变农艺性状可遗传突变率=（成苗株数/处理种子数×100）×（M1代发生诱变率+M2代发生诱变率）×突变性状可遗传比率。

1.4 数据处理

采用Excel和SPSS 22.0软件对试验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 不同EM S剂量和诱变时间处理下芝麻种子的萌发情况

表1显示，清水处理下，芝麻种子萌发正常，生长活力较强，发芽势为89.63%～94.02%，发芽率达到93.56%～98.20%，根长为5.29～6.20 cm，活力指数为451.13～551.33。当EMS质量分数为0.1%时，随着处理时间延长，种子萌发受抑制程度逐渐增大。其中，处理6 h（A1B1），种子萌发率为97.65%，根长为5.3 cm，活力指数为506.73；处理12 h（A1B2），虽然种子萌发率仍较高（98.67%），但根长降低为2.97 cm，活力指数下降至274.50；处理24 h（A1B3），种子萌发率显著降低（为71.09%），根长及活力指数进一步下降，分别为2.00 cm和131.00。当EMS质量分数提高至2%时，种子发芽势均为零；种子发芽率较低，并接近或达到零（0.00～24.00%）；根长和活力指数显著受到抑制。当EMS质量分数分别为0.5%、1.0%、1.5%，各处理6、12、24 h时，9个处理的发芽势、发芽率、根长及活力指数4个指标或部分指标也表现出了显著差异。结果表明，0.1%/ 24 h（A1B3）、0.5%/24 h（A2B3）、1.0%/12 h（A3B2）和1.5%/6 h（A4B1）处理下，种子发芽势、发芽率在53.13%～90.17%，根长为0.30～2.00 cm，活力指数为18.53～131.00，可作为芝麻EMS处理半致死筛选的适宜条件。鉴于芝麻籽粒小、种子萌发易受大田环境影响等因素，同时考虑试验时间，本试验从A1B3、A2B3、A3B2和A4B1处理条件中优先选择了1.0% EMS浸种12 h，用于后续的芝麻EMS突变体库构建。

2.2 EM S诱变芝麻M1代农艺性状突变类型及频率

2008—2010年，采用1.0%EMS/12 h条件，共处理91-0株系芝麻种子7万粒。通过营养钵播种、大田移栽，共获得EMS诱变处理材料22 855株，成株率为32.65%。分别在幼苗、现蕾、盛花、成熟及收获期，系统调查M1各植株的叶型（叶色、叶形）、株型（成熟茎杆色、茎杆茸毛量、茎秆类型、株高、节间长度）、花器与育性（每叶腋花数、花器形态、颜色、雌蕊数、雄蕊数及育性）、蒴果及粒型（蒴果形态、颜色、大小、茸毛量、心皮数、裂蒴性、蒴粒数、千粒质量及种皮色）及其他表型（生育期长短、发育进程）等5类24个田间农艺性状（表2）。从试验结果可以看出，在22 855个M1代植株中，共有1 736株表现出了田间性状变异，变异率为7.60%。在5类突变性状中，花器与育性为主要突变类型，占总株数的4. 08%，其次是蒴果及粒型，突变比率为1.59%。

2.3 EM S诱变M2代农艺性状突变类型及频率

为分析隐性EMS诱变特征，2009—2012年，随机选取了M1代表现正常的7 978份植株，按家系单行条播种植，并进行了M2株系调查；共筛选出了突变株系222份，变异频率为2.78%（表2）。在M2株系中，突变的主要农艺性状类型仍为花器与育性，占总调查株系的0.93%。如花序有限（DS899）、密蒴短节（Dw607）、花冠瓣状（Si CP412）等突变类型（图1d、e）。其次是叶型（0.86%），如杯型叶（Si CC045）、叶片黄化（Si AS31216）等突变类型（图1b、c）。

2.4 EM S突变体农艺性状可遗传概率分析

为进一步明确上述突变类型是否具有遗传性和稳定性，从具有表型突变的M1、M2株（系）中随机挑选了831个突变株（系），系统调查其M2或M3后代的突变性状（表2）。结果显示，在831个M2、M3突变株系中，共有197个株系稳定遗传了突变性状，稳定突变的比率为23.71%。主要突变类型为蒴果及粒型，占总调查株系的14.80%，包括蒴果多棱（心皮数大于2）、大蒴、小蒴、大粒及小粒等变异类型（图1h、i）。结果表明，采用EMS诱变技术可以创制丰富的芝麻突变体。

根据上述诱变成株率（32.65%）、M1发生诱变率（7.60%）、M2代发生诱变率（2.78%）以及突变性状可遗传比率（23.71%）计算确定，在1.0%EMS浸泡12 h诱变处理条件下，91-0株系籽粒后代发生可遗传突变率为0.80%，即从理论上讲，每处理1万粒芝麻种子，获得可稳定遗传的叶型等性状突变体的数量为80份。

3 结论与讨论

EMS诱变技术是应用最为广泛的农作物育种技术之一。目前育种家们利用EMS诱变已成功创制出了大批具有高产、优质、早熟、矮杆、抗病、抗逆等优良农艺性状的农作物新种质［20］。本研究在明确适于芝麻的最佳EMS诱变条件基础上开展大规模EMS诱变处理，首次构建了芝麻EMS突变体库。在1.0%EMS浸泡12 h诱变处理条件下，91-0株系后代发生诱变株系的可遗传突变率为0.80%。可以认为，芝麻是较适于采用EMS技术创制优异新种质的物种。本研究获得了22 855个芝麻诱变株系，初步获得M1突变体1 736份，M2突变体222份；已确定可稳定遗传的突变体197份，为芝麻种质创新、新品种选育以及功能基因组学研究提供了宝贵材料。目前创制出的花序有限型（DS899）和密蒴短节型（Dw607）突变体，已成功用于我国首批适于机械化生产的芝麻新品种选育（新品种权公告号：CNA013391E、CNA013392E），为推动芝麻产业发展奠定了坚实的材料基础。

大量研究结果表明，EMS诱变剂量对诱变材料的获得和筛选具有重要影响。在诱变剂量选择过程中，一般多以处理后植株存活一半的剂量即半数致死剂量（LD50）作为诱变敏感性指标［21］，但不同作物选用的EMS剂量和处理条件不尽相同。在小麦、拟南芥突变体库构建过程中，通常以降低苗高10%～ 30%的EMS质量分数作为适宜剂量［20］；卢银等［21］选用0.4%EMS浸泡16 h条件构建大白菜突变体库，M2群体中变异频率最高达到了25.65%；在1.0% EMS处理下，甘蓝型油菜的幼苗致死率接近50%［8］，而石从广等［22］则认为，1.2%EMS对诱导油菜发生大量突变最为有利。芝麻EMS诱变研究中，多选用低质量分数（0.5%～1.0%）进行EMS诱变处理［23］。采用5 g/L EMS处理8 h后，芝麻91-0的发芽率高于50%；进一步增加处理时间或者剂量，其发芽势、发芽指数和种子活力则急剧下降［24］。本研究中，1.0%EMS浸种浸种12 h和1.5%EMS浸种6 h均是导致芝麻致死的临界条件，在两处理条件下，芝麻种子活力指数分别为46.47和18.53，与对照及致死处理的结果均有显著差异。大规模诱变及诱变株农艺性状调查结果显示，在1.0%EMS浸种12 h处理条件下，芝麻M1和M2代的农艺性状突变率分别为7.60%和2.78%，突变性状在后代中仍可稳定遗传的比率为23.71%。表明采用1.0%EMS浸种12 h可成功获得大量稳定遗传的芝麻突变体。同时也应看到，在构建的芝麻诱变体库中，部分株系的突变性状在后代中未能得到稳定遗传，这可能与EMS生理损伤、调查群体大小、突变位点特征以及突变性状调控的复杂性等因素有一定关系［20，25］。

受工作量大等因素限制，本研究仅分析了部分重要农艺性状，调查指标涉及叶型、株型，花器、蒴果及生理等农艺性状，有关抗病（芝麻枯萎病和茎点枯病）、抗逆（干旱、耐渍等）、品质（籽粒含油量、蛋白含量、木酚素含量）等重要性状的突变比率尚待分析和公布，而这些性状对全面评价芝麻EMS诱变体系及突变规律将具有重要作用。除创制优异种质外，利用诱变技术构建饱和突变体库也是开展作物功能基因组研究的重要途径［25］。目前，芝麻基因组计划已全面完成，高质量芝麻基因组精细图的构建为大规模开展芝麻功能基因研究提供了技术平台［17］，芝麻突变体库的构建则为快速推动芝麻功能基因组学研究提供了材料基础。因此，今后将继续开展芝麻EMS诱变创制，以进一步丰富芝麻突变体库；同时，将深入开展芝麻突变体库基因突变位点分布和诱变机制研究，以加快我国和世界芝麻遗传育种研究进程。

［1］ Bedigian D，Harlan JR.Evidence for cultivation of sesame in the ancientworld［J］.Economic Botany，1986，40（2）：137-154.

［2］ Jules J.Plant breeding reviews［M］//Ashri A.Sesame breeding.Oxford：Oxford Press，1998：179-228.

［3］ Pham T D，Thi Nguyen T D，Carlsson A S，et al.Morphological evaluation of sesame（Sesamum indicum L.）varieties from different origins［J］.Australian Journal of Crop Science，2010，4：498-504.

［4］ Kumar V，Sharma S N.Comparative potential of phenotypic，ISSR and SSR markers for characterization of sesame（Sesamum indicum L.）varieties from India［J］. Journal of Crop Science and Biotechnology，2011，14（3）：163-171.

［5］ Sìlme R S，Çargˇirgan MÌ.Screening for resistance to Fusarium wilt in induced mutants and world collection of sesame under intensive management［J］.Turkish Journal of Field Crops，2010，15（1）：89-93.

［6］ 陈忠明，王秀娥.水稻强优势恢复系9311粒重的诱变改良［J］.分子植物育种，2005，3（3）：353-356.

［7］ Till B J，Reynolds S H，Weil C，et al.Discovery of induced pointmutations in maize genes by TILLING［J］.BMC Plant Biology，2004，4（1）：12.

［8］ 李浩杰，蒲晓斌，张锦芳，等.甘蓝型油菜EMS诱变后代农艺性状观察及分子检测［J］.核农学报，2012，26（2）：245-249.

［9］ 王培英，王连铮，朴德万.EMS诱发大豆脂肪酸组成优良突变的研究［J］.核农学报，1993，7（2）：81-87.

［10］ Tsuda M，Kaga A，Anai T，et al.Construction of a highdensity mutant library in soybean and development of a mutant retrieval method using amplicon sequencing［J］. BMC Genomics，2015，16（1）：1014.

［11］ Menda N，Semel Y，Peled D，et al.In silico screening of a saturated mutation library of tomato［J］.The Plant Journal，2004，38（5）：861-872.

［12］ 石淑稳.诱变技术在芝麻品种改良中的应用［J］.中国油料，1991（2）：93-96.

［13］ Begum T，Dasgup ta T.A comparison of the effects of physical and chemicalmutagens in sesame（Sesamum indicum L.）［J］.Genetics and Molecular Biology，2010，33（4）：761-766.

［14］ Kumar G，Yadav R S.EMS induced genomic disorders in sesame（Sesamum indicum L.）［J］.J Biol Plant Biol，2010，55（2）：97-104.

［15］ 刘艳阳，梅鸿献，崔承齐，等.EMS、NaN3和60Coγ-射线处理对芝麻根尖的细胞学效应［J］.河南农业科学，2012，41（12）：47-51.

［16］ 卫文星，卫双玲，张海洋，等.芝麻新品种豫芝11号的选育［J］.河南农业科学，1999（7）：3-4.

［17］ Zhang H Y，Miao H M，Wang L，et al.Genome sequencing of the important oilseed crop Sesamum indicum L.［J］.Genome Biology，2013，14（1）：401.

［18］ 张秀荣，冯祥运.芝麻种资源描述规范和数据标准［M］.北京：中国农业出版社，2006.

［19］ International Plant Genetic Resources Institute，National Bureau of Plant Genetic Resources.Descriptors for sesame（Sesamum spp.）［M］.New Delhi：National Bureau of Plant Genetic Resources，2004.

［20］ 刘翔.EMS诱变技术在植物育种中的研究进展［J］.激光生物学报，2014，23（3）：197-201.

［21］ 卢银，刘梦洋，王超硕，等.EMS处理对大白菜种子和幼苗活力的影响及M2表型变异分析［J］.植物遗传资源学报，2015，16（2）：349-358.

［22］ 石从广，孟华兵，姜宇晓，等.甘蓝型油菜EMS诱变二代农艺与籽粒品质性状的变异与TILLING库的构建［J］.核农学报，2010，24（6）：1132-1140.

［23］ WongyaiW，Saengkaewsook W，Veerawudh J.Sesame mutation induction：Improvement of non-shattering capsule by using gamma rays and EMS［R/OL］.［2016-06-19］. http：//www.iaea.org/inis/collection/NCLCollection.Store/-Public/32/007/32007915.pdf.

［24］ 刘艳阳，梅鸿献，武轲，等.浸种温度与化学诱变剂对芝麻种子发芽的影响［J］.河南农业科学，2012，41（11）：39-44.

［25］ 赵天祥，孔秀英，周荣华，等.EMS诱变六倍体小麦偃展4110的形态突变体鉴定与分析［J］.中国农业科学，2009，42（3）：755-764.

Optimization of EMSMutagenesis Condition and Screening of Mutants in Sesame

WANG Huili，ZHANG Haiyang，MA Qin，WEI Libin，JU Ming，LIChun，DUAN Yinghui，MIAO Hongmei*
（Sesame Research Center，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

In order to clarify the effects of EMS concentration and treat duration on sesame mutation efficiency，seeds of sesame line 91-0 were immersed in EMS solution with various concentrations from 0.1%to 2.0%for 6—24 h.The results showed that the treatments with 0.1%EMS for 24 h，0.5%EMS for 24 h，1.0%EMS for 12 h and 1.5%EMS for 6 h were appropriate for sesame mutagenesis.Under the above treatment conditions，the seed germ ination potential and the germination rate ranged from 53.13%to 90. 17%，the root length varied from 0.30 cm to 2.00 cm，the average vigor index varied from 18.53 to 131. 00.To obtain abundantmutants，70 000 seeds of line 91-0 were treated under the optimal condition of 1. 0%EMS for 12 h during 2008—2010.As a result，22 855 mutated lines were harvested with the p lant generation ratio of 32.65%.During themutagenesis investigation，24 agronomic traits related to five groups of traits，i.e.leaf type，p lant type，flower and fertility，capsule and seed characters and other physical traits for sesame were app lied.Investigation results indicated that the mutation frequencies in M1and M2generation were 7.60%and 2.78%，respectively.For M1and M2populations，flower and fertility were the top mutation trait type with the high ratios of 4.08%and 0.93%，respectively.Further observation of 831 mutants random ly selected from the EMSmutant library reflected that 23.71%mutants stably descented the mutation traits in the progenies.The top mutated trait of the mutation type was capsule and seed characters，occupying for 14.80%of the total investigated lines.Morphological variation results predicted that the mutation frequency of line 91-0 reached 0.80%under 1.0%EMS for 12 h induction condition.

sesame（Sesamum indicum L.）；ethyl methanesulfonate（EMS）；mutagenesis；mutant library；frequency

S335.3；S565.3

A

1004-3268（2017）01-0036-06

2016-08-02

现代农业（芝麻）产业技术体系建设专项（CARS-15）；国家自然科学基金项目（31301653，31471537）；河南省科技创新人才计划项目（164200510001）；河南省重大科技专项（151100111200）

王慧丽（1980-），女，河南郸城人，助理研究员，本科，主要从事芝麻遗传育种研究。E-mail：273778144@qq.com

*通讯作者：苗红梅（1974-），女，河南永城人，研究员，博士，主要从事芝麻遗传育种与病害基础研究。E-mail：miaohongmeichina@yahoo.com