环丙氨嗪在畜牧养殖业中的应用及其检测技术研究进展

邢云瑞，姚静静，王方雨，孙亚宁，邓瑞广，胡骁飞*

(1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州450002； 2.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471000)

环丙氨嗪在畜牧养殖业中的应用及其检测技术研究进展

邢云瑞1，2，姚静静1，王方雨1，孙亚宁1，邓瑞广1，胡骁飞1*

(1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州450002； 2.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471000)

环丙氨嗪是一种常用的昆虫抑制剂类杀虫剂，对畜禽养殖场的蝇蛆繁殖控制效果显著，在畜牧养殖业中应用广泛。然而长期使用环丙氨嗪易造成细菌耐药性，从而危害动物健康，且会在动物组织中形成药物残留，并通过食物链危害人类健康，甚至危及生命。因此，环丙氨嗪的监控检测对保证食品安全至关重要。综述了环丙氨嗪的性质、应用、危害、检测方法等，并展望了免疫学检测技术在环丙氨嗪监控检测中的应用前景，以期为环丙氨嗪的科学应用及监控检测提供参考。

环丙氨嗪； 药物残留； 食品安全； 检测技术

环丙氨嗪是一种高效的昆虫生长抑制剂，常作为饲料添加剂广泛应用于动物饲料中，以原药以及代谢产物的形式随粪便排出体外，并沉积在粪便中以杀灭粪便中的蝇蛆，从而达到净化环境的目的，且能提高动物生长性能[1]。在动物养殖生产过程中，许多养殖户为了减少养殖场的蚊蝇，把环丙氨嗪长期应用于动物饲料中，导致畜禽肌肉组织中药物残留超标，严重威胁着消费者身体健康。我国及美国已经将其列为具有潜在致癌性化合物[2]。世界各国对其在动物制品中的残留做了严格的限量要求，目前，关于环丙氨嗪监控检测的研究较少。因此，综述了环丙氨嗪的性质、应用、危害、检测方法等，旨在为环丙氨嗪的应用及监控检测提供参考。

1 环丙氨嗪的理化性质

环丙氨嗪，又名“灭蝇胺”，养殖场通常称为“蝇蛆净”，化学名为2-环丙氨基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪，分子式为C6H10N6，属于1,3,5-三嗪类昆虫生长调节剂，为无色晶体，微溶于水[1-2]。美国食品药品监督管理局(FDA)和美国环境保护署(EPA)于1974年正式批准生产[1]。本品主要作用于昆虫发育过程中的第2个阶段，具有很强的杀虫抑虫性能，其杀虫抑虫活性明显优于其他种类杀虫剂，且不受交叉抗药性的影响[2-3]。

2 环丙氨嗪在动物饲料中的应用

近年来，环丙氨嗪广泛应用于畜牧业，用来控制畜禽舍以及周围环境中的有害昆虫，效果显著，并能够促进动物生产性能的提高。环丙氨嗪在动物饲料中的应用主要是作为预混剂拌入全价料中，动物体内的环丙氨嗪绝大部分以原药形式随粪便排出体外，并在粪便中杀灭蝇蛆，通过诱使蝇蛆在形态上发生畸变,使成虫羽化不全或受到抑制,从而达到控制蝇蛆过量繁殖的目的,其药效可以达到4～6周[4]。

环丙氨嗪作为饲料添加剂在不同种属动物的饲料中均有应用，在鸡饲料中应用最为广泛且效果显著。环丙氨嗪的常用剂型不仅有预混剂，还有水溶剂和注射剂。由于预混剂具有操作方便、经济效益显著的特点，在畜牧养殖过程中使用广泛。将1%的环丙氨嗪以0.05%(质量分数)的比例拌入饲料中，饲喂不同年龄段的鸡群，其粪便自然堆放，不会产生各种蝇蛆，且对其产蛋量等生产性能指标无明显影响[1]。江善祥[5]将环丙氨嗪预混剂按2 mg/kg混饲给药，结果表明，给药后1 d至停药后1 d，各处理组鸡粪中蝇蛆死亡率均为100%。翁亚彪等[6]在供试鸡群每吨饲料中添加蝇灭(含1%环丙氨嗪的饲料添加剂)500 g，结果显示，蝇灭能很好地控制粪便中蝇蛆的孳生繁殖。环丙氨嗪也可用于猪、牛、羊等生产中。同时采用混饲、混饮、气雾喷洒的方法驱虫灭蝇，用药第8天，苍蝇数量明显减少[7]。Robert等[8]在实验室条件下，采用环丙氨嗪混饲给药方法检测环丙氨嗪对不同动物粪便中普通家蝇的抑制效果，环丙氨嗪添加剂量分别为鸡1.5 mg/kg，猪、牛0.5 mg/kg，连用5 d，停药24 h后观察，结果显示，鸡和猪粪便中普通家蝇均被100%抑制，并且持续时间较长，而牛粪便中普通家蝇抑制效果不及鸡和猪。Williama等[9]采用环丙氨嗪混饲和喷洒2种途径来检测环丙氨嗪控制鸡粪中普通家蝇繁殖的效果，在混饲试验中，环丙氨嗪的添加剂量为1.5 mg/kg，采用给药1 d、停药 1 d的模式进行，用药结束后，普通家蝇致死率为100%；喷洒给药时,环丙氨嗪剂量为 0.025%、0.050%和 0.100%，用药17 d后，普通家蝇均减少 70%或更多。Hart等[10]将环丙氨嗪溶液(1 g/L)喷洒羊全身，能有效地降低蚊蝇所引起的疾病的发生率，随着药物剂量的提高,对绵羊无不良影响。Miller等[11]将环丙氨嗪作为饲料添加剂应用于牛，厩舍内蝇类的繁殖在一定程度上受到抑制，检测发现，奶牛排出的尿液中含有一定量的环丙氨嗪。杨金琛等[12]将环丙氨嗪药液对五龄期 4～12日龄柞蚕进行喷蚕喷叶处理，处理4 d后，柞蚕体压升高、体躯伸长、节间膜膨起，导致产生6.1%～46.4%畸形蛹，雌蛾产卵量显著降低。

3 环丙氨嗪药物动力学及残留规律

环丙氨嗪通过口服可以迅速被吸收，其血浆药物质量浓度在1.8 h后就可以达到0.2 mg/L，生物利用率(AUC)达到34%，在一定剂量范围内，其AUC与剂量呈正相关，多次给药并不会产生蓄积。药物被吸收后广泛分布在肝脏、胆囊、体液、直肠、肾组织及组织体液中。环丙氨嗪在吸收一段时间后的消除作用主要通过以原药形式经肾排泄、肠道排泄、肝生物转化来实现。动物试验结果表明，环丙氨嗪的再吸收及排泄迅速。饲喂环丙氨嗪24 h后，其中80%～95%通过尿液排泄，2%～7%经粪便排出体外[1,13]。

环丙氨嗪在吸收、分布、消除转化的过程中产生了一定的残留。研究发现，环丙氨嗪残留的主要器官是肝脏和肾脏。牛应用环丙氨嗪的研究表明，在肾脏中残留含量最高，其次是板油和肝脏，肌肉中也有少量存在。当环丙氨嗪深入动物脂肪组织中时，在动物产品中可以检测到少量残留，由于环丙氨嗪不能通过血脑屏障，因此，在脑组织中通常检测不到残留。鸡饲料中添加环丙氨嗪，连续用药16周后，在鸡蛋、脂肪、肌肉中均能检测到残留。牛、羊连续用药后，在奶、肌肉、脂肪中均检测到残留。在饲养过程中许多养殖户为了控制圈舍蝇蛆繁殖而将环丙氨嗪长期应用于产蛋期鸡饲料和肥育猪、牛、羊饲料中，不遵循休药期规定，这样就造成了动物源性食品中的药物残留，并最终威胁到人类健康[14-17]。

4 环丙氨嗪残留危害

目前，已经有越来越多的证据表明，环丙氨嗪具有一定的毒性作用。Wilson等[18]将不同剂量的环丙氨嗪混饲喂养来航种鸡，以此来判断环丙氨嗪对种鸡繁殖性能的影响，结果显示，当环丙氨嗪质量浓度为2 000 mg/kg时，产蛋量明显下降，种蛋孵化率降低，但精子质量不受影响。Brake等[19]在蛋鸡不同日龄混饲不同剂量的环丙氨嗪，观察环丙氨嗪对蛋鸡产蛋量、种蛋孵化率及雏鸡健康状况的影响。结果显示，1 000 mg/kg组雏鸡死亡率明显高于其他组。50周龄时各组蛋壳质量无显著差异，但60周龄时，300 mg/kg及1 000 mg/kg组蛋壳质量明显降低。Brake等[20]将环丙氨嗪以不同剂量(0、500、1 000、2 000 mg/kg)混饲饲喂1～16周龄火鸡，测定环丙氨嗪对火鸡不同性能的影响，结果显示，2 000 mg/kg剂量组的火鸡性成熟前生长缓慢，性成熟后，受精率和蛋质量降低。尸检发现，肾脏损伤严重，出现肿大、结节和坏死灶症状。在慢性、亚慢性毒理试验中，环丙氨嗪可导致动物体质量下降，肝脏肿大，血细胞数量减少。环丙氨嗪在动物体内代谢产物为三聚氰胺，残留的环丙氨嗪最终导致三聚氰胺的蓄积，从而对动物机体或者人类产生危害[21]。

为了确保动物源性食品中残留的环丙氨嗪对人体不会产生危害，目前我国及世界上其他国家规定了动物性食品环丙氨嗪的残留上限。美国环境保护署规定，在牛、羊、马、猪、鸡的脂肪、肌肉及副产品中，环丙氨嗪的最高残留量为0.05 mg/kg，在鸡蛋中为0.25 mg/kg[22]。我国农业部规定在牛和鸡的肌肉、脂肪、肝、肾组织中，环丙氨嗪最高残留量分别为0.3 mg/kg和0.05 mg/kg[23]。

5 环丙氨嗪的监控监测技术

环丙氨嗪滥用导致的药物残留严重威胁人类健康，因此，监控监测环丙氨嗪对保证动物产品安全、维护消费者健康安全尤为重要。

目前，国内外已报道的检测环丙氨嗪的方法主要包括气相色谱法(GC)[24-25]、气相色谱质谱联用法(GC-MS)[26]、傅里叶变换红外(FTIR)光谱法[27]、傅里叶变换拉曼(FT-Raman)光谱法、高效液相色谱法(HPLC)及衍生方法[28-35]。高效液相色谱法是包括美国食品药品监督管理局等组织使用的经典方法。鸡组织和鸡蛋中的环丙氨嗪分别采用提取液乙腈/水(90/10，V/V)、甲醇/水(90/10，V/V)来提取，阳离子、阴离子交换柱净化，最后用甲醇定容后采用4.6 mm×250 mm NH2柱，以乙腈/水(95/5，V/V)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为214 nm。该方法肝脏和鸡蛋中回收率分别为108.3%～108.7%和64.3%～68.7%[30]。蒋成君等[36]建立了环丙氨嗪含量测定的高效液相色谱方法，采用 Phenomenex Podigy Cr18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，以甲醇/乙腈/缓冲液(5/2/93,V/V/V)为流动相，流速为 2.0 mL/min，检测波长 214 nm,柱温 20 ℃。该方法线性范围为 0.007 99～0.012 29 mg/mL，系统精密度为0.25%，平均回收率为99.2%。Shin等[37]建立了高效液相色谱法检测禽肉和蛋中环丙氨嗪残留的方法，样品中环丙氨嗪用乙腈/氨水(80/20，V/V)提取，萃取净化后溶于乙腈进行分析。分别以C18柱、乙腈/0.5×10-3mol/L硫酸(15/85，V/V)为流动相，NH2柱、乙腈/水(75/25，V/V)为流动相作对比，前一种方法环丙氨嗪的保留时间低于4 min，增加乙腈含量并不能延长保留时间，因此,不适宜作为分析模式;第二种分析模式下，药物的吸收峰与杂质吸收峰有明显区别，分离效果较好，检测限为0.02 mg/kg，回收率超过92.8%。周炜等[38]建立了高效液相色谱法检测鸡、鸭、羊可食性动物组织中环丙氨嗪残留检测方法，样品用提取液(V乙腈∶V1%三氯乙酸溶液=15∶85)提取后，用MCX固相萃取柱净化，最后采用高效液相色谱仪测定。方法的检测限为10 μg/kg，定量限为25 μg/kg，回收率在74.4%～107.0%，批内变异系数在0.9%～11.9%，批间变异系数在0.3%～11.1%。樊苑牧等[39]建立了采用高效液相色谱法测定含脂羊毛中灭蝇胺的方法，样品用80 mL的1%三氯乙酸溶液超声提取,MCX柱净化,Hypersil NH2色谱柱分离,水/乙腈为流动相梯度洗脱,214 nm波长处检测，灭蝇胺检出限为0.02 mg/kg。钱鸣蓉等[40]建立了亲水作用色谱-串联质谱测定蔬菜中灭蝇胺及其代谢物三聚氰胺的方法，将蔬菜样品匀浆后经甲醇-水提取，取适量酸化后提取液，用阳离子固相萃取柱净化，洗脱液用氮气吹干，残留物用 5 mL流动相定容。采用亲水作用色谱分离，在电喷雾-选择反应监测模式下，进行定性和定量分析。以基质校正曲线计算，添加剂量为0.04 mg/kg时，灭蝇胺的回收率为 84.2%～101.3%，灭蝇胺的定量限为 0.01 mg/kg。陆春波等[28]采用FTIR光谱和FT-Raman光谱2种方法来测定固体农药制剂中环丙氨嗪的含量，FTIR光谱法中，采用甲醇萃取环丙氨嗪，测定萃取物在1 622 cm-1的峰高，FT-Raman光谱法则是在拉曼光谱强度为623～633 cm-1时直接测定固体粉末样品。

虽然上述这些方法灵敏度及准确度高，且是国际贸易争端的仲裁方法，但这些方法均具有不足之处，需要对样品进行复杂的前处理，处理所用的仪器设备价格昂贵，且检测耗时较长，检测费用较高，且需要专业的技术人员进行操作等，只能在一些先进的科研院所及食品、饲料安全监督监测单位使用，限制了其推广普及。随着我国食品安全形势的发展，急需建立操作简单、检测快捷、费用低廉的环丙氨嗪检测技术。

酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是经典的免疫分析方法，是以抗原抗体的特异性反应为基础建立起来的分析检测方法，具有灵敏性强、特异性高、操作简便快捷等优点，适用于大批量样品的快速检测分析。因此，检测范围也由最初的病毒、细菌的检测扩大到了兽药、农药、激素及毒素等半抗原小分子的定量检测[41-44]，在临床医学、生物学和分析化学等领域得到了极为广泛的应用。截止目前，国内外均未见利用免疫学方法检测环丙氨嗪的相关文献报道。环丙氨嗪属于小分子化合物，可以通过选择合适的偶联方法合成环丙氨嗪人工抗原，然后通过单克隆抗体技术获得特异性强、敏感性高的环丙氨嗪单克隆抗体，利用ELISA的原理建立起检测食品中环丙氨嗪的免疫学快速检测方法，组装环丙氨嗪快速检测试剂盒，用于环丙氨嗪含量的检测。这种检测方法，不需要使用高昂的仪器设备，操作简单易行，适合进行大批量样品的快速检测。所以，环丙氨嗪免疫学检测技术产品具有比较广阔的市场前景。

6 展望

随着环丙氨嗪在畜禽养殖业中的普及使用，环丙氨嗪残留所带来的危害也越来越明显，尽管环丙氨嗪理化检测方法能够相对准确地测定饲料及畜产品中的环丙氨嗪，但畜禽养殖企业迫切需要的是经济、简便、快捷的环丙氨嗪检测技术，免疫学技术可以很好地解决这一问题，可以通过免疫学技术制备出环丙氨嗪单克隆抗体，开发 ELISA检测试剂盒。除此之外，还可以结合荧光偏振、各种化学发光技术、胶体金标记等，研制出更加灵敏、观测结果更方便的检测产品。这些检测方法更加简便、快捷，在监控检测饲料中环丙氨嗪含量的同时，不仅能及时发现环丙氨嗪造成的食品安全隐患，还可以更好地控制环丙氨嗪的滥用及可能造成的危害。

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Research Progress of Application and Detection Methods of Cyromazine in Animal Husbandry

XING Yunrui1,2,YAO Jingjing1,WANG Fangyu1,SUN Yaning1,DENG Ruiguang1,HU Xiaofei1*

(1.Henan Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 2.College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471000,China)

Cyromazine is a common insects inhibitor,which has significant effects on controlling maggot breeding of livestock and poultry farms.It is widely used in animal husbandry.However,the long-term use of cyromazine would lead to drug-resistance of bacteria and subsequently damages animal health.Moreover,it also leads to the drug residues in animal tissues，meanwhile,it does harm to human health and even life through the food chain.Therefore,monitoring and detection of cyromazine is crucial to ensure food safety and the health of consumers.This paper summarizes the properties,applications,harm,residue detection methods of cyromazine and gives a perspective to the application of immunological detection methods in the monitoring and detection of cyromazine,so as to provide a reference for further research of cyromazine related work.

cyromazine; drug residue; food safety; detection methods

2016-06-03

国家科技支撑计划项目(2014BAD13B05)；河南省农业科学院优秀青年基金项目(2016YQ27)；河南省基础前沿项目(142300413222)

邢云瑞(1990-)，女，河南舞阳人，在读硕士研究生，研究方向：食品安全快速检测。E-mail：xyrui1201@163.com

*通讯作者：胡骁飞(1972-)，男，河南汝南人，副研究员，博士，主要从事饲料食品免疫学快速检测技术研究。 E-mail：huxf1972@126.com

S859.79

A

1004-3268(2017)03-0020-05