SNP分子标记技术在经济甲壳动物中的应用进展

赵 莲，薛 蓓，高 焕,2,3，阎斌伦,2,3

(1．江苏省海洋生物技术重点实验室，淮海工学院，连云港 222005； 2. 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，连云港 222001; 3. 江苏省农业种质资源保护与利用平台，南京 210014)

·综述·

SNP分子标记技术在经济甲壳动物中的应用进展

赵 莲1，薛 蓓1，高 焕1,2,3，阎斌伦1,2,3

(1．江苏省海洋生物技术重点实验室，淮海工学院，连云港 222005； 2. 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，连云港 222001; 3. 江苏省农业种质资源保护与利用平台，南京 210014)

作为第三代分子标记，单核苷酸多态性标记(SNP)具有丰富度高、密度大、稳定性强、共显性等特点，成为目前虾、蟹等经济甲壳动物中应用最广泛的分子标记技术。本文对经济甲壳动物中SNP技术的发展及其在高密度遗传连锁图谱的构建、种质资源遗传多样性分析、分子辅助育种等方面的应用进展进行了综述，并提出了未来有待加强的研究方向，以期为经济甲壳动物种质资源的开发和利用提供理论指导。

SNP； 经济甲壳类； 研究进展； 种质资源

作为第三代分子标记的典型代表，单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism，SNP)与传统分子标记(RFLP、RAPD、SSR)相比，不仅具有多态性高、分布广、遗传稳定性强等特点，而且可以实现高通量、自动化检测，具有低成本、高效率的优点[1]，因而成为研究生物表型与基因型之间关系的重要桥梁[2]。随着分子标记及其检测技术的不断发展，SNP分子标记技术发展迅速，已广泛应用于畜牧业种质资源的鉴定[3]、植物遗传图谱的构建[4]、人类疾病的防控[5]等诸多研究领域。

近年来，SNP标记技术在水产生物研究中也得到了广泛应用，已经用于藻类品种鉴定[6]、鱼类遗传结构及多样性分析[7-8]以及贝类基因多态性关联研究[9]等方面，并取得了重要进展。目前，该标记技术在经济甲壳动物中也得到了广泛的应用，在甲壳类生物遗传图谱的构建、种质资源遗传结构与遗传多样性分析以及分子标记辅助育种等方面都取得了重要的研究进展。本文对此进行综述，以期为甲壳类生物优良品种的开发及其资源的可持续发展提供新的思路和理论指导。

1 甲壳类生物中应用到的SNP标记检测技术

作为新型分子标记技术，SNP的检测技术也在不断地推陈出新，包括以单链构象多态性[10](single-strand conformational polymorphism, SSCP)、酶切扩增多态性序列[11](cleaved amplified polymorphic sequences, CAPS)、片段差异等位基因特异[12](fragment length discrepant allele specific PCR, FLDAS-PCR)等基于凝胶电泳技术的传统检测方法，以焦磷酸测序[13](pyrosequencing)、微测序[14](SNaPshot)等直接测序法以及高分辨率熔解曲线分析[15](high resolution melting, HRM)等基于高通量、自动化程度较高的新兴检测技术。与鱼类、贝类等其它水生动物相比，SNP标记在甲壳类生物中的开发与应用较晚，但发展迅速。目前甲壳类中应用到的SNP检测技术主要有SSCP、直接测序、HRM等。

1.1 SSCP

SSCP检测技术依据单个或多个核苷酸的差异而引起单链DNA的空间构象的差异，使得长度相同或相近的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)中的迁移速率不同，从而检测出基因的多态性。随着PCR技术的发展，SSCP被广泛用于PCR产物的检测，即PCR-SSCP[10]，该检测技术由于成本低廉、操作简单，被认为是SNP最为经典的检测方法之一[16]，近年来，也成为甲壳类生物SNP多态性检测常用的技术手段[17-18]。

但是，该检测技术对于引物设计、PCR产物、制胶等方面均有严格的要求[19]，因此存在操作繁琐、耗时等缺点。此外SSCP检测技术只能定性地判断基因片段的多态性，不能对突变位点进行准确定位与分型，因此该检测技术不适用于高通量的SNP检测与分型，因而研究者转而开发更为快速、实用的SNP分型技术。

1.2 直接测序技术

直接测序技术通过对比不同样本的同一基因或基因片段的PCR扩增产物的测序结果进行直接对比来发掘SNP位点[20]。与SSCP相比，直接测序技术具有高通量、自动化程度高且能够准确检测出突变类型和突变位点，同时也避免了电泳等繁琐程序，使染色体数量较多的甲壳类生物的SNP检测水平得到了极大的提高。CIOBANU等[21]利用直接测序技术将凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、斑节对虾(Penaeusmonodon)以及日本囊对虾(Penaeusjaponicus)的基因组序列进行对比分析，最终在凡纳滨对虾基因组中筛选出了1221个候选SNPs；LIU等[22]通过直接测序在凡纳滨对虾的ESTs中发掘出17 225个候选SNPs。直接测序技术为甲壳类生物高密度SNP遗传连锁图谱的构建提供了技术条件。

与传统克隆测序相比，直接测序技术具有快速、直接、稳定等优点[23]，但是该技术对PCR产物的特异性要求较高，同时也受模板大小及用量的影响；此外该技术应用于高通量的SNP检测与分型，所耗成本较高，因此限制了SNP标记的大量开发、利用和推广。

1.3 HRM

高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting, HRM)，最早由犹他大学和爱德华科技公司联合开发，是以常规高分辨率曲线分析技术、饱和荧光染料(ResoLight 、LCGreen、SYT09)以及采集荧光信号的仪器相结合而发展起来的新型SNP检测及其分型技术。该技术在PCR结束后，直接进行高分辨溶解曲线分析，通过饱和染料监控核酸溶解过程得到特征性溶解曲线，再根据熔解曲线的变化来判断核酸性质的差异[24]。在国内，吴莹莹等[25]首次将该技术应用到中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)免疫相关基因SNP的检测，并把不同SNP基因型与抗WSSV的特性进行了关联分析，这为甲壳类生物优良品种的快速选育奠定了良好的基础。

与SSCP、直接测序等其它检测技术相比，该技术不仅能够实现SNP的高通量与自动化检测，而且能对纯合子、杂合子基因型进行准确区分[20,26-27]。该检测技术用于SNP分析时主要有两种方法可供选择，一是非标记探针法，其过程是先进行不对称PCR，扩增出的目的条带再与互补探针进行杂交，加入荧光染料，通过Light Scanner系统可显示不同的溶解曲线；二是小片段法，使用了与双链DNA结合的饱和荧光染料，荧光信号强度与DNA双链浓度成正比，通过逐步增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线，该熔解曲线的一阶导数图在DNA双链的Tm值上有一特征峰，具有不同Tm值的DNA双链形成的特征峰的位置存在差异[28]。非标记探针技术对于已知SNP位点可以快速地进行检测，但在SNP位点分布较为密集的片段区域，其分析存在一定的困难，此外该分型技术在探针的设计与不对称PCR的过程均有着严格的要求，因此存在既耗时又繁琐的缺点，不利于该分型技术的推广。相较于非标记探针法，小片段法不仅特异性强，避免了前者复杂的操作过程，而且降低了SNP的开发成本，提高了开发效率[29]。

1.4 其它检测方法

理论上，任何用于检测单个碱基突变或者多态的方法均可用于SNP的识别与检测。甲壳类生物染色体数目较多，其基因组中SNPs分布广泛，但随着检测技术及检测设备的迅速发展，实现对这些SNPs高通量、自动化检测已成为可能。自2005年以来，以罗氏公司研发的454测序仪(Roch GS FLX sequencer)、美国Illumina公司的Solexa基因组分析平台(genome analyzer platform)等为代表的高通量测序技术相继诞生[30]，这为甲壳类生物中庞大数量的SNP标记开发奠定了重要基础。ZHANG等[31]在454高通量测序系统的基础上，针对中国明对虾设计引物，最终筛选出180个SNP标记，首次建立了中国明对虾的SNP连锁图谱；李希红[32]基于Illumina HiSeq 2000 双端测序，然后进行序列对比分析，最终分别在中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)的肝胰腺和幼体转录组中分别筛选出60 517和49 555个SNPs。

对于SNP检测的方法还有很多，目前无论何种SNP的检测技术和方法都应考虑其是否具备快速、简便、高通量、低成本等条件。

2 SNP分子标记技术在甲壳类中的应用

2.1 高密度遗传连锁图谱的构建

相比大多数鱼类和贝类，经济甲壳类动物由于染色体数量较多[33-34]，因此需要构建的遗传连锁图谱群也随之增多，这给高密度遗传连锁图谱的绘制带来了一定程度的困难。而相比于其它分子标记而言，SNP标记所具有的位点分布广、多态性高、呈共显性遗传等独特的优势[35-36]，使其成为经济甲壳类动物遗传连锁图谱构建的强有力工具。DU等[37]在凡纳滨对虾中绘制出了首张SNPs连锁图谱。张建勇[38]首个构建了中国明对虾的雌雄SNPs图谱，由21个连锁群组成，分别包括119、115个SNP位点，全长分别为876.2、879.7 cM，覆盖率分别为53.77%和51.94%。

随着越来越多的SNP被开发，其图谱覆盖整个染色体基因组的程度也越来越高，FOLEY等[39]利用190个SNPs在一种小型甲壳类动物海洋水蚤的250个子代个体间构建出了图谱全长为401 cM，其覆盖率达73.7%。BARANSKI等[40]在斑节对虾中应用3 592个SNPs绘制了一个可覆盖整个核基因组高达82%的连锁图谱。

2.2 种质资源遗传结构及遗传多样性研究

目前，SNP标记技术主要集中应用于虾、蟹等经济甲壳类群体品种鉴定[41]、基因组遗传结构变异[42]及多样性分析[43]等领域的研究与应用。SNP标记在甲壳类种质鉴定、遗传结构及遗传多样性分析方面也得到了广泛应用。高天翔[44]利用部分线粒体DNA(12S rRNA)试图将中华绒螯蟹和日本绒螯蟹(Eriochierjaponica)这两个品种区分开来，但由于该区域的保守性，无法将其区分；随后，孔晓瑜等[45]基于线粒体DNA的COI基因，寻找其单核苷酸多态性，结果显示该两种绒螯蟹确实来自于两个不同的品种。此外，ZHANG等[41]最终在中华绒螯蟹、合浦绒螯蟹(Eriocheirhepuensis)的Cytb和COI区分别找到了能够稳定遗传的SNP位点，并成功开发出基于SNP标记的DNA条形码。

由于过度捕捞，野生群体资源在不断地减少，利用SNP标记技术对自然群体或者不同部分地理群体的遗传结构进行分析，评估其遗传多样性情况，可为后续的种质资源管理与保护提供指导作用。FENG等[46]在拟穴青蟹的转录组中成功开发出91个SNPs，其中40个标记已在30个野生个体间得到了分型与标记，为该群体遗传多样性的追踪奠定了重要基础。BATTA等[42]在南极大磷虾(Euphausiasuperba)mtDNA的Cytb区中发现了能稳定遗传的SNP位点，并对2001～2002年间南极半岛区域该生物的线粒体结构进行了差异分析，结果显示该区域的群体存在分化现象，为进一步研究其它区域该群体的进化历程(起源、迁入、迁出、遗传、漂变)奠定了重要基础。

2.3 分子标记辅助育种

利用分子标记技术进行辅助育种，已成为动物育种过程中重要的手段和方法。SNP标记由于在基因组中分布广，如在人类中每1 000 bp就存在一个SNP位点[47]，因此，这些标记与特定性状基因关联的潜在可能性很高[48]，这为筛选与该分子标记连锁的特定性状相关功能基因提供了机会，进而为展开相应的分子标记辅助育种奠定了基础。

2.3.1 生长性状相关功能SNP位点筛选

与鱼类、贝类等其它水产动物相比，甲壳类动物有其独特的生长发育史，受多个基因共同调控，因此其生长发育调控机制也会相对复杂。目前，与甲壳类生长相关基因有淀粉酶基因[49-50](AMY)、组织蛋白酶基因[18,51](CTSL)、蜕皮抑制激素[52](MIH)、肌肉生长抑制素基因[53](MSTN)等，但是这些基因的多态性与其相应的功能关联研究还不多，仅集中于AMY、CTSL等少数几个基因上。辛静静[18]在凡纳滨对虾AMY基因外显子区发现A4、A5、A6基因座以及CTSL基因外显子区C6基因座均存在SNP位点，对这些基因多态性与生长性状的关联进行分析，结果显示AMY与CTSL基因多态性对该生物的生长发育均有一定程度的影响。

2.3.2 抗病性状SNP位点的筛选

病害是危害经济甲壳类养殖效益的重要因素之一，因此寻找特定抗病的基因或者SNP位点已成为甲壳类分子标记辅助育种中的一个热点。逄锦菲[54]在中国明对虾中筛选出了与抗WSSV(white spot syndrome virus, 白斑综合症病毒)性状有关的9个SNPs；随后，刘敬文[55]在凡纳滨对虾多家系抗WSSV实验中，发现凡纳滨对虾的一种重要免疫效应因子ALFs序列中有多个SNPs位点。近年来，在中华绒螯蟹、拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)、对虾等甲壳类抗病性状基因SNPs筛选进程中也取得了重要的突破。李希红[32]在全基因组范围内规模化筛查与抗病相关的SNP位点，结果显示，在中华绒螯蟹重要免疫组织肝胰腺及其幼体转录组中分别检测到60 517和49 555个SNP标记位点，并经过免疫实验，发现其中一些SNP位点与中华绒螯蟹抗病有着一定的相关性；YANG等[56]和BLANCK等[57]分别在拟穴青蟹的HSP70基因、亚马逊淡水虾(Macrobrachiumamazonicum)HSC70基因中均发现了SNP位点。

2.3.3 其它性状相关SNP位点的研究

近年来，育种专家们不仅筛选了一些与甲壳类生长、抗病性状基因相关的SNP位点，据目前相关研究来看，研究者在甲壳类抗压力、耐盐、性早熟等性状基因多态性的研究上也取得了一定的成果，为SNP标记用于后续优良品种的辅助选育奠定了坚实的基础。LIU等[22]在研究凡纳滨对虾选择性压力性状基因多态性关联时筛选出了7 298个与该性状可能有关的SNP位点；唐刘秀[58]通过探究蜕皮抑制激素基因(MIH)与性早熟性状的相关性时，最终发现有两个SNP位点(A3088T、C2466C)与中华绒螯蟹性早熟性状之间存在密切关系；王渝[59]在研究与渗透压调节密切相关的钙网蛋白基(PtCRT)时，通过直接测序也发现该基因上存在耐盐相关SNP位点的可能。

3 小结与展望

综上所述，SNP标记技术在经济甲壳动物的遗传多样性、高密度连锁图谱的构建、与生物优良性状关联分析等研究领域均表现出良好的应用前景，使其成为所有分子标记中最受瞩目的分子标记。但我们也要看到，甲壳类生物SNP标记的开发和应用在很多方面还有待加强，比如在增殖放流标志技术和分子标记辅助育种技术的完善和应用上仍然有很长的路要走，这些问题都有待我们展开更深入的SNPs开发和应用上的研究工作。

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Progress on the SNP molecular markers in economic crustaceans

ZHAO Lian1， XUE Bei1， GAO Huan1,2,3， YAN Bin-lun1,2,3

(1.JiangsuKeyLaboratoryofMarineBiotechnology,HuaihaiInstituteofTechnology,Lianyungang222005,China;2.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofMarineIndustryTechnology,Lianyungang222001,China;3.JiangsuConservationandUtilizationPlatformofAgriculturalGermplasmResources,Nanjing210014,China)

As one of the third generation markers, Single Nucleotide Polymorphism (SNP) marker with lots of advantages, such as rich density, high stability and co-dominance, is widely used in the crustaceans.In this paper, the development and application of SNP technology used in economic crustaceans was reviewed. The research progress on the construction of high density genetic linkage map, analysis of genetic diversity and marker assisted selection breeding in crustaceans were summarized. It will be helpful to deepen the further studies of the development and utilization of economic crustacean germplasm resources.

SNP; economic crustacean; research progress; germplasm resources

1004-2490(2017)02-0233-08

2015-12-14

国家自然科学基金(31472282)；江苏省高校自然科学研究项目(13KJA240001);江苏省农业科技支撑计划(BE2013363)；江苏省水产三新工程(D2014-17);江苏省2015年度普通高校研究生科研创新计划项目(KYLX15-1486)

赵 莲(1990-)，女，四川内江人，硕士研究生，主要从事甲壳类遗传学研究。 Tel: 0518-85895252，E-mail:zhaolianalice@163.com

阎斌伦，教授。 E-mail:yanbl@hhit.edu.cn

Q 755

A