植物快速加代技术研究及应用

2017-02-03广州大学植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室广州大学生命科学学院广东广州50006广州农业科学研究院广东广州50006

种子 2017年7期

, , , , , , , (.广州大学植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室，广州大学生命科学学院，广东广州 50006；.广州农业科学研究院，广东广州 50006)

·综述·

植物快速加代技术研究及应用

孔曜1,姚焱1,郭培国1,李荣华1,张平1,黄红弟2,李光光2,张华2
(1.广州大学植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室，广州大学生命科学学院，广东广州 510006；2.广州农业科学研究院，广东广州 510006)

获得遗传稳定的植物永久分离群体或新品种需要多年时间，成为限制作物遗传研究及育种的瓶颈。研究者利用多种方法加速植物世代的进程，尤其是人工调控生长条件与幼胚培养结合法的研究和应用，使植物短时间内建成遗传稳定的群体或品系成为可能。应进一步开展该技术规范化、工厂化实施的应用研究，提高大规模应用的可能性；同时与分子标记技术结合，提高我国农作物遗传改良的效率和水平。

快速加代；胚培养；逆境调控；遗传改良

永久分离群体是现代植物育种及遗传学研究的重要基础和材料。双单倍体DH(doubled haploid)群体和重组自交系RILs(recombinant inbred lines)是应用较普遍的分离群体。DH技术是已知的、可在1代内有效实现基因稳定的方法，但由于DH群体的建成受到基因型限制，许多植物种或基因型目前无法建成DH群体, 而且还减少了遗传重组及选择的机会[1]。利用SSR单籽传代法建立重组自交系RILs，不受基因型的限制而普遍采用。为了构建重组自交系，需要F2群体通过单籽传代法(SSD)自交至少5～6代才能够获得遗传稳定的群体[2]。在育种实践中，对于亲缘关系较近的单交组合，加代到F4即可；双交、复合交或亲缘关系较远的需要加代至F5～F6甚至更高的代数[3]。由于许多作物1年1代或2年1代，过长的加代时间成为瓶颈。为此，作物遗传及育种研究者通过多种方法加速植物世代的进程。

1 田间快速加代方法

田间快速加代一般可以分为异地加代和就地保护设施加代两类。是指将植物材料种植于田间，植物依据育种地的地理特性、气候条件完成自然世代周期。某些情况下辅助以人工设施完成生长周期[3]。

1.1 异地加代法

受地理、季节、光热条件影响，许多作物1年只能进行1季的生长，若要1年繁殖多代，多采取异地加代方式。中国地域辽阔、地形复杂、气候多样。采用异地加代繁育方式，如夏季已种植1代的育种材料，冬季移至海南南方地区再种植1代；或利用北方地区气候冷凉、昼夜温差大、日照时间长等特点，将东南部地区育种材料再移至北方青海等地加代种植。这样南北交替种植，1年繁育多代，可以缩短育种年限，加快新材料、新品种的选育。许多作物通过此种方式成功进行加代[4-9]。但异地加代也存在一些问题：异地繁殖可能造成检疫性病害、虫害、草害流行；南方热带地区病、虫害易发生，增加了灾害控制的人力物力投入；北方繁育基地受到气候、热量条件制约，只能满足某些类型品种生长制种的需求，对生育期较长类型易受冻害而导致减产或绝收[4]。异地加代操作成本比较高[10]。

1.2 当地保护地设施加代法

为克服异地加代的问题，也可以借助当地日光温室、塑料大棚等设施，调节室内温度、光照和水肥条件，使植物在不适宜生长的季节也能在设施内继续生长，达到一年繁殖多代的目的。在多种作物上较普遍地应用[11-14]。

异地加代法与当地温室大棚加代法均可解决因季节变换导致的温度限制，能够实现1年多代。2种方法差别在于，异地加代法需要在异地建立育种基地、规划育种用地，适合大规模育种；当地温室大棚加代法，无需异地选址，适合较小规模的作物异季加代。

2 人工调控生长条件与幼胚培养结合法

王海波等认为，加速植物的发育需要以下突破： 1) 加速植株发育(指从出苗到开花阶段)。植物的生长发育受水、肥、光、气、热的影响, 通过人为调控环境条件可以有效加速植物的发育进程； 2) 缩短种子发育( 指从受精到种子成熟阶段)。种子植物大都有1～2个月或更长的种子发育期,借助离体培养技术直接诱导幼胚成苗,省去种子发育时间。 3) 快速度过春化过程(从种子萌动到通过春化)[1，15]。

2.1 人工调控生长条件

人工调控生长条件，通过提高光照强度、调节光照时间(长日照植物延长光照时间，短日照植物控制光照时间)、控水控肥等措施制造植物生长的逆境环境，加速植物的营养生长和生殖生长的进程。

余阳俊等发现，加强光照强度可以促进大白菜的生殖生长和营养生长，一定量的营养生长对加速大白菜植株抽薹开花也有促进作用[16]。光周期超过16 h，抽薹开花期则明显提早,以24 h效果最佳；花研等的研究表明，随光照时间延长，番茄的开花时间缩短[17]；尹守恒等研究了光照时间与韭菜抽薹开花结实之间的关系，结果表明，延长光照时间，韭菜的抽薹期提早了3～5 d、始花期提前2～4 d[18]；Williams 和Hill[19]利用人工培养条件，持续24 ℃、光照20 h/d、光强250μmol/(m2·s)环境中实现了芸薹属植物36～60 d繁殖一代；王海波等[15]将小麦置于温度25～32 ℃，光照14～18 h/d条件下，繁殖1代需66～69 d，1年可以繁殖5代；Zheng等[20]、Liu等[21]在此基础上将光照时间延长至16～20 h/d，光强500 μmol/(m2·s)条件，进一步缩短了小麦1代时间；燕麦1代70～80 d，小黑麦68～81 d，为正常田间生长时长的一半左右；Ochatt等[22]在人工控制光温条件的温室中，在20/16 ℃ 日/夜(高温不超过26 ℃)，每天16 h钠灯或日光灯泡照射下，使豌豆94 d繁殖1代，1年可连续繁殖4代；Mobini 和Warkentin[23]将光照延长至20 h/d，光强 500 μmol/(m2·s)(5支荧光灯管)下生长，可以使豌豆34 d开花，68 d收获1代；Yao等[24]的研究表明，在温度25 ℃/22(±1)℃ (日/夜)以及65%/85%(日/夜)相对湿度、光照20 h/d、光强500 μmol/(m2·s)条件下，油菜62～71 d繁殖1代，而正常田间1代需要112～116 d。以上研究表明，长日照植物在人为延长光照时间下有助于缩短生育期，如芸薹属植物、麦类、豌豆可以在20～24 h下连续光照促进发育。

许多热带、亚热带和温带春秋季开花的短日照植物，如大豆、玉米、水稻等，每天光照超过12 h反而会推迟开花，使世代周期延长，因此加代处理时需要依据植物的光周期特性区别处理：水稻和玉米在20～38 ℃下光照8 h/d、棉花和大豆在20～35 ℃下光照10 h/d，水稻和棉花1年完成4代，玉米和大豆1年完成5代[15]；班巴拉花生在27 ℃/25 ℃(日/夜)，光照10 h/d强度5 000 lx下生长，1年可以繁殖3代，而正常田间1代需要280～300 d[22]。而较高温度对促进植物开花及授粉后胚的发育有一定作用，如25～30 ℃下小麦种子成熟期比温度20 ℃下提早15～20 d，较高的环境温度促进种子发育和成熟[25]。

营养元素对植株发育有重要作用。钮心恪等[26]在控温温室中用园土与蛭石(1∶1)培养基质和Hoaglard’s营养液栽培大白菜，70 d内完成了1个世代。土壤或营养液中含N量高时会延长小麦的营养生长, 而P,K等高时则促进生殖发育[1，27]。较高量的钾、微量元素、植物桔秆、种子粉碎物、草木灰、糠醛渣等都表现了较强的促小麦植株发育的作用，王海波等[1]研制出适合小麦加代的土壤配方，既能加快发育速度,又能获得较大的营养体和生殖体。土壤营养调控也可以通过土钵体积进行调整。Liu等在对燕麦和小黑麦快速加代时发现，较少的培养土提高了植物的逆境胁迫条件，促进了植物开花，但降低了植株育性，当增大培养土体积和适当供肥后，有助于提高植株结实率[21]。

土壤水分含量也影响植物发育速度。适当干旱可以提早植物开花、缩短生育期[21，24]；人工环境下的湿度对植株的发育影响也很大,湿度过大会抑制蒸腾作用削弱植株发育；结实期过多水也将延迟胚发育速度，应适当控水处理[1]。

需要注意的是，过强的逆境环境也会影响植物的正常生长、影响花粉发育及结实等[28]。因此，快速加代时的逆境条件要适度：温度和光照的条件控制应依据不同物种植物的需要进行相应调整；水分和肥力控制需要依据植物生长状况，既能保证每一代的快速加代，又能满足一定结实率，实现多代持续繁殖的目的。

2.2 幼胚培养

幼胚培养是指通过人工离体培养，诱导植物的幼胚直接发育成苗而省去种子成熟、萌发过程的技术[29]。刚收获的种子一般都具有休眠期,需要一定时间解除休眠后，种子才可顺利萌发成苗[30]。幼胚培养技术，省去了种子成熟时间以及萌发前解除休眠所需时间，可以有效缩短世代时间。

植物幼胚培养时胚龄的选择和培养基成分对幼胚培养成功起着关键作用。不同物种适宜的幼胚培养时间及培养方法存在差异。贾春兰等[31]在大白菜的加代繁殖过程中，剥取绿熟期种子中的倒生胚进行离体培养,结果得到，白菜倒生胚生长的适宜培养基为MS+2,4-D 0.01～0.005 mg/L+6-BA 1～2 mg/L+蔗糖2%，诱导生根培养基为MS+IBA 0.2～0.4 mg/L+蔗糖2%，采用固态培养基与液态培养基交替使用的方法诱导幼胚萌发成苗，可以缩短种子成熟期10～20 d；王海波等[15]发明了适合于多种植物的快速加代技术，将小麦、水稻、玉米、棉花、大豆的幼胚(适宜培养的幼胚胚龄为小麦8～12 d、水稻12 d、春夏玉米10 d、春夏大豆14 d和棉花10 d)培养在PM培养基上诱发成苗，实现5种作物60～89 d内繁殖1代；于清涛等[32]将四季萝卜花后25 d胚龄的胚进行离体培养，结果幼胚成活率在90%以上；严慧玲等[33]将甜(辣)椒授粉后30～35 d的幼胚接种到MS培养基上诱导成苗，可缩短种子成熟期20～30 d；王涛涛等[34]将甘蓝和芥菜型油菜不育系远缘杂种胚在授粉后10 d进行培养，在MS基本培养基中添加1 mg/L BA，0.1 mg/L NAA和活性炭的条件下诱导胚发育成苗；何道一等认为，大豆开花后20 d的幼胚结合高温预处理(37 ℃)能够显著提高幼胚萌发率和成苗率，不同培养基对成苗率无显著影响[35]；Zheng等[20]、Liu等[21]和Yao等[24]分别将小麦、大麦、燕麦、小黑麦和油菜的12 d胚龄的幼胚置于改良的MS+10% 椰青汁培养基中，7～14 d后产生的幼苗即可移入土壤进入下一代周期。实现小麦和大麦1代39～55 d、燕麦和小黑麦1代48～61 d和油菜1代48～56 d，与单纯人工环境调控下加代相比，每代缩短20～25 d的种子成熟时间，实现1年繁殖6～9代；Ochatt 等[22]将豌豆幼胚置于改良的MS培养基上诱导成苗，实现63 d 1代，而田间正常生长需要143 d；班巴拉花生幼胚在BM添加0.5～1 mg/L NAA的培养基上诱导出苗良好，85～90 d繁殖1代；Mobini 和Warkentin[23]将豌豆开花后13～17 d胚龄的幼胚置于HS (Holland SecretTM) 培养基进行幼胚培养成苗，1年内可以连续繁殖7代并成功建立2个豌豆RILs。研究中发现，由于环境条件对开花授粉后胚的发育有很大影响，适宜培养的胚龄数不是固定不变的。较高的温度条件、适当控水将促进胚发育，使适宜离体培养的胚龄提前[24]。如授粉后将小麦植株移到较高的温度 25～28 ℃环境，24 h全光照，可使幼胚培养时间提前1～2 d[1]；对于诱导胚成苗的培养基成分，目前还无普遍适宜的配方，需依据不同植物种类进行调整。

2.3 加速春化过程

春化是某些高等植物在低温诱导下促使成花转变的过程[36]。低温是一些2年生植物(如白菜、甘蓝、青花菜、芹菜、胡萝卜等)和1年生冬性植物(如小麦、黑麦等)诱导花发生所必需的条件,如果在这些植物可以感受低温诱导时期,进行一定时间的适宜低温处理,可以缩短其生育时间,促使其提前开花结实[37]。有研究表明，种子出于自身保护或环境适应所形成的一系列先“休眠”或“抑制”，然后再慢慢解除这种“休眠”或“抑制”的机制, 不仅使其发育过程变得复杂, 也无谓地拖长了春化和苗穗期阶段的发育时间, 减少这种曲折便可简化发育过程[1,15]。利用幼胚培养萌苗，不仅可节省种子后熟所耗的时间, 还减少了“发育抑制物”的积累。对于冬性小麦材料，越早开始幼胚培养，春化越非必要条件。如冬小麦9306种子正常条件下须经30 d春化处理才能抽穗，而其15 d胚龄的幼胚经离体培养的诱导苗不经春化也能抽穗结实[15]。Zheng等[20]，Liu等[21]和Yao等[24]分别将小麦、大麦、燕麦、小黑麦和油菜的不同早、中、晚熟品种进行幼胚培养诱导成苗后，均不需要低温春化处理，可以在39～56 d内完成开花结实的过程。这些也表明幼胚培养可以有效减少种子内“发育抑制物”的积累，为克服春化过程加速植株发育提供了途径。

对于冬性较强的材料，如果幼胚培养成苗也无法完全克服春化过程，那么寻找快速通过春化的办法是快速加代的重要切入点。冬小麦加速发育进程的方法值得借鉴：在小麦胚培养出苗1～3 d 后开始春化(一般选择苗龄小但体积大的植株更易进行)，冬性较强的材料春化25～30 d,冬性较弱的材料春化20～25 d；春化结束前用KT 溶液泡根2 d, 有助于加速发育[1]。丁晓义等[38]将小麦胚龄为12～14 d的幼胚置于PM培养基培养3～4 d,然后在8～10 ℃、1 000 lx、24 h/d的光照条件下春化处理25～30 d，可使小麦个体发育加速，实现1年繁殖5代。

3 展望

植物快速加代技术，极大地加快分离群体材料遗传稳定的速度和进程，在重组自交系的基础上进一步发展为近等基因系、单片段代换系等，便于重要基因的精确定位，在植物遗传研究中有重要价值；在育种实践中，快速加代技术为新品种快速选育提供了条件。目前，人工调控生长条件与幼胚培养结合技术在许多植物中还需要依据不同植物生物学特性开展规范化、工厂化实施的应用研究，提高大规模应用的可能性；为使快速加代技术有效地发挥作用,应加快主要作物重要经济及农艺性状的分子标记研究，将加代技术与分子标记选择结合加速植物的遗传改良，进一步提高我国农作物遗传改良的效率和水平。

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(本栏目责任编辑：周介雄)

Studies and Applications in Plant Rapid Generation Technology

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2017-01-26