年龄相关性白内障合并糖尿病晶状体前囊膜MMP- 2、TIMP- 2、ⅣC 和LN 的表达

年龄相关性白内障合并糖尿病晶状体前囊膜MMP- 2、TIMP- 2、ⅣC 和LN 的表达

褚俏梅周茜曹西友李方都

目的探讨基质金属蛋白酶-2( MMP-2) 、基质金属蛋白酶-2 组织抑制因子( TIMP-2) 和Ⅳ胶原纤维( ⅣC) 、层粘蛋白( LN) 在合并糖尿病和非糖尿病的年龄相关性白内障晶状体前囊膜的表达及意义。方法应用免疫组织化学技术测定30 例年龄相关性白内障合并糖尿病患者( 试验组) 和30 例非糖尿病的年龄相关性白内障患者( 对照组) 晶状体前囊膜中MMP-2、TIMP-2、ⅣC 和LN 的表达，并比较其差异。结果MMP-2 在试验组白内障晶状体前囊膜中多呈高表达，阳性率为90. 3%，对照组MMP-2 表达阳性率为0. 0%，差异有统计学意义(P<0.01) ;而试验组和对照组晶状体前囊膜中TIMP-2、ⅣC 和LN 均呈高表达( 阳性率分别为80. 0% 和73. 3%，96. 7% 和100. 0%，96. 7%和100. 0%) ，差异无统计学意义(P>/span><0.05) 。试验组晶状体前囊膜TIMP-2 与LN 的表达之间成正相关( r = 0. 371，P<0.05) 。结论合并糖尿病的年龄相关性白内障晶状体前囊膜中MMP-2 与TIMP-2 表达严重失衡，认为这种失衡在合并糖尿病的年龄相关性白内障发生发展过程中可能起着重要的作用。

年龄相关性白内障; 2 型糖尿病; 晶状体前囊膜: 基质金属蛋白酶-2; 组织抑制因子; IV 胶原纤维:层粘蛋白

糖尿病性白内障的发生机制是机体内外各种因素对晶状体长期综合作用的结果，虽然糖尿病性白内障发病机制、发生过程与非糖尿病的年龄相关性白内障有所不同，但发现其两者病理表现极为相似。年龄相关性白内障当长期伴有糖尿病时，发病机制可能更加复杂。晶状体前囊膜中基质金属蛋白酶等成分的改变为白内障主要的病理异常。本研究应用免疫组化技术检测30 例年龄相关性白内障患者和30 例合并2 型糖尿病的年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜中基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinase2，MMP-2) 、基质金属蛋白酶2 组织抑制因子( tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2，TIMP-2) 和IV 胶原纤维( collageen IV，IVC) 、层粘蛋白( laminin，LN) 的表达情况，旨在探究不同基质成分及其之间表达的的相关性以及在两种不同白内障中表达的临床意义。

资料与方法

一、 对象

随机收集我院2013年4月至2014年4月进行手术的白内障患者晶状体前囊膜60例(60只眼)。试验组为合并2型糖尿病( 病史5年以上) 的年龄相关性白内障30例(30只眼)，其中男性7例(7只眼)，女性23例(23只眼)，年龄55～ 88岁，平均年龄72.5岁。对照组为未合并糖尿病的年龄相关性白内障患者30例(30只眼)，其中男性10例(10只眼)，女性20例(20只眼)，年龄50～90岁，平均年龄71.1岁。排除严重心脑疾病。

术前排除青光眼、视网膜脱离、葡萄膜炎、眼外伤及内眼手术史。糖尿病患者术前血糖均稳定在8. 0 mmoL /L 以下，年龄相关性白内障患者术前血糖为4.3 ～ 6.1 mmol /L，平均(5.2 ± 0.9) mmol /L。全身检查血常规、凝血功能、肝肾功能、心电图、胸片均无手术禁忌症。

二、方法

本研究所有患者手术前均被告知手术风险并签署知情同意书，手术均由同一名医师完成。严格按照内眼手术操作标准，常规消毒铺无菌巾、表面麻醉下冲洗结膜囊，予2%利多卡因及等量0.75%布比卡因混合液3～5 ml行球后、球周及结膜下注射。

1.标本采集:60例白内障患者均行单眼白内障超声乳化术。术中前房注入粘弹剂，连续环形撕囊，直径6mm，将撕取的晶状体前囊膜置EP小管内，放－42℃冰箱保存待测。

2.试剂: MMP-2、TIMP-2 、ⅣC 和LN鼠抗人单克隆抗体、SP二抗试剂盒和二氨基联苯胺( DAB)显色剂均购自Dako 生物技术( 上海) 有限公司。

3.免疫组织化学染色: 取出冷冻的前囊膜，室温下复温后，立即置入4%多聚甲醛液中，4℃冰箱固定12h，常规石蜡包埋，连续切片，贴附于经APES浸泡并用多聚赖氨酸处理过的载玻片上，进行免疫组织化学染色。SP免疫组化染色方法: 将石蜡标本制成2～3μm 的切片，切片脱蜡至水，3 % H2O2去离子水，37℃温箱30min去除内源性过氧化物酶，微波修复，二抗同源血清封闭。一抗湿盒中4 ℃冰 箱过夜，二抗37 ℃温箱30 min，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。PBS 代替一抗为阴性对照，阳性对照切片为上海Dako生物技术( 上海) 有限公司的标准阳性对照。其余切片分别行MMP-2、TIMP-2、ⅣC 和LN 染色。

4.结果判定: 晶状体前囊膜上皮细胞质内有棕黄的染色颗粒为阳性细胞，细胞质内无棕黄色颗粒为阴性细胞。400倍光学显微镜下随机选择5 个视野，判读阳性细胞的百分比，定性分析MMP-2、TIMP-2、ⅣC 和LN 染色分布。

三、统计学方法

计数资料用阳性例数和阳性率表达，数据组间率的比较用χ2 检验，两指标间相关性采用Spearman等级相关性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、试验组和对照组晶状体前囊膜中MMP-2染色见图1A、B; 试验组和对照组晶体前囊膜中TIMP-2染色见图1C、D。

图1

① 试验组晶体前囊上皮细胞质内呈现棕黄色颗粒，示MMP－2阳性表达; ② 对照组晶体前囊上皮细胞质内未见棕黄色颗粒，示MMP－2阴性表达; ③ 试验组晶体前囊上皮细胞质内呈现棕黄色颗粒，示TIMP－2的阳性表达; ④ 对照组晶体前囊上皮细胞质内呈现棕黄色颗粒，示TIMP－2的阳性表达。( SP × 400)

表1 两组晶状体前囊膜中MMP-2、TIMP-2、ⅣC 和LN阳性表达的分布情况阳性表达率%( 阳性例数/总例数)

二、表1 显示，试验组患者晶状体前囊膜中MMP-2 的阳性表达率与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01) ，TIMP-2 的阳性表达率与对照组比较，差异无统计学意义(P>/span><0.05) ; 试验组中ⅣC、LN 的阳性表达率与对照组比较，差异均无统计学意义(P>/span><0.05) 。

三、表2 显示，试验组晶状体前囊膜中，MMP-2、TIMP-2、ⅣC、LN 阳性表达核性白内障多于后囊下性; 对照组除MMP-2 全部阴性外，TIMP-2、ⅣC 和LN 阳性表达核性多于后囊下性。试验组晶状体前囊膜中MMP-2 的阳性表达率高于对照组，其差异有统计学意义( χ2 = 52. 500，P = 0.000) 。两组间晶状体前囊膜中TIMP-2、ⅣC、LN 的阳性表达率差异无统计学意义。

表2 年龄相关性白内障分型晶体前囊膜MMP-2、TIMP-2、ⅣC 和LN 阳性表达

四、经Spearman 等级相关分析，晶状体前囊膜中MMP-2、TIMP-2、ⅣC、LN 阳性表达率之间均无相关性。试验组中晶状体前囊膜中TIMP-2 与LN 的表达之间成正相关( r = 0. 371，P<0.05) 。MMP-2与TIMP-2、ⅣC、LN 以及ⅣC 与LN 的表达之间相关性均无统计学意义(P>/span><0.05) 。

讨 论

糖尿病性白内障的诱因比较清晰，而年龄相关性白内障发病机制迄今尚未完全明确，多认为与年龄老化、紫外线长期过度照射、遗传因素、营养不良等有关。虽然糖尿病性和年龄相关性白内障发表的机制有所不同，但其晶状体上皮细胞( LEC) 的病理性改变比较相似，均被证实有基质成分发生变化，且白内障的发生均与晶状体上皮细胞的凋亡密切相关，糖尿病性白内障超微结构的细胞凋亡改变更加严重[1]。有研究观察发现: 晚期糖基化终末产物受体及受体在糖尿病性白内障晶状体上皮细胞中的表达高于年龄相关性白内障，说明糖尿病性白内障的发病与其密切相关[2]。高糖对糖尿病微血管ECMs成分的影响明显，因此年龄相关性白内障患者一旦伴有严重的糖尿病，在高糖的环境下，晶状体上皮细胞的损伤机制将更加复杂。

白内障患者晶状体囊膜细胞外基质成分的表达以ⅣC、LN 表达为主，并在白内障术后晶状体上皮细胞的移行、增殖中发挥作用。更多的临床资料显示，ⅣC、LN 也与后发性白内障与晶状体上皮的移行有关，且伴有糖尿病的患者后发性白内障的发病率更高。故了解晶状体上皮细胞的病理机制对指导治疗更有其临床意义。研究表明，后囊下性白内障是与细胞外基质异常有关的疾病[3]。本文研究显示，无论是否合并糖尿病晶状体囊膜细胞ⅣC、LN均为高表达。

MMP-2 是降解细胞外基质和基底膜的一类重要酶类，在细胞迁移分化和组织修复重建中均发挥重要作用，TIMP-2 是MMP-2 的特异性抑制物，细胞外基质的稳定主要依赖于MMP 与TIMP 间的动态平衡的调节。在体内，MMP-2 及其TIMP-2 共同调节Ⅳ型胶原和LECs 的增殖[4]。ⅣC 和LN 分别是MMP-2 和MMP-9 的特异性底物，故研究显示，MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1 在所有年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞均呈阳性表达，认为这些基质金属蛋白酶和组织抑制剂参与了年龄相关性白内障的发病[5-7]。当TIMP-2 高表达而MMP-2 的低表达时，说明TIMP-2 通过与其羧基端结合形成高亲合力的复合物来抑制MMP-2 的活性[8]。本研究结果发现，合并糖尿病的年龄相关性白内障晶状体前囊膜细胞MMP-2 与TIMP-2 均呈高表达，且TIMP-2 与LN 表达又呈正相关，而未合并糖尿病时其MMP-2 与TIMP-2、ⅣC、LN 表达为负相关。同时发现，在60 例年龄相关性白内障分型中，核性多于后囊下性，与国内相关报道相符[9]。研究显示，未合并糖尿病的年龄相关性白内障晶状体前囊膜MMP-2 几乎不表达，而无论是否合并糖尿病其晶状体前囊膜细胞TIMP-1、ⅣC、LN 均有表达，分析认为，MMP-2 的表达在年龄相关性白内障被明显抑制，此与TIMP-2 功能增强有关。MMP-2 对细胞外基质和基底膜中的ⅣC、LN 的降解可能会降低，使MMP /TIMP 调节达到动态平衡。而合并糖尿病的年龄相关性白内障呈现MMP-2 和TIMP-2 均高表达，说明MMP /TIMP 的调节动态失衡，或许其失衡与高糖环境中的酶和蛋白的破坏有关。两组间的差异虽然不能肯定就是合并糖尿病的年龄相关性白内障发病的主要机制，且MMP /TIMP 与晚期糖基化终末产物及其受体的相关性也还有待与进一步研究，但本研究结果对揭示合并有糖尿病的年龄相关性白内障更易发生后发性白内障的机制[9]有一定价值。

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ExpressionofMMP-2，TIMP-2，ⅣCandLNorintheanteriorcapsuleofthelensofaged-relatedcataractpatientswithdiabetes

ChuQiaomei,CaoXiyou,ZhonQian,LiFangdu.

DepartmentofOphthalmology；DepartmentofPathology；DepartmentofNuclearMedicine,ShanghaiLiqunHospital,PutuoDistrict,Shanghai200333,China

ObjectiveObjective To investigate the expression and role of matrix metalloproteinase 2 ( MMP-2) ，tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2 ( TIMP-2) and collagen IV ( ⅣC) and laminin ( LN) in lens anterior capsuleof aged － related cataract with and without type 2 diabetic．MethodsThe expressions of MMP-2，TIMP-2，ⅣC and LNwere detected by immunohistochemistry in 30 cases of aged-related cataract with diabetic ( experimental group) and 30 caseswithout diabetic ( control group) and results were compared between the two groups． Results Positive strong expressionof MMP-2 was found in lens anterior capsule of the experimental group，and rate was 90. 3%，compared to the controlgroup in which the expression of MMP-2 positive rate was 0. 0% (P<0.01) ． In experimental and control groups，expressionsof TIMP-2，IV-C and LN ( positive rate) was 80. 0% vs． 73. 3%，96. 7% vs． 100. 0%，and 96. 7% vs． 100. 0%，respectively． There was no statistically significant difference (P<0.05) ． In the experimental group，the expression ofTIMP-2 was positively correlated with the expression of LN ( r = 0. 371，P<0.05) ． Conclusions The expression ofMMP-2 and TIMP-2 in lens anterior capsule of aged － related cataract with diabetes is seriously unbalanced，which is believedto play an important role in the occurrence and development of aged-related cataract with diabetic.

Aged － related cataract; Type 2 diabetes mellitus; Anterior capsule of the lens; Matrix metalloprotein-ase 2; Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2; laminin

[JClinOphthalmol,2017,25:389]

10.3969/j.issn.1006-8422.2017.05.002

200333 上海，普陀区利群医院眼科( 褚俏梅，曹西友) ，病理科( 周茜) ，核医学科( 李方都)

曹西友( E-mail: lfd_915@ sina.com)

[临床眼科杂志，2017，25：389]

(收稿：2017-03-22)