人EGFR突变基因检测试剂注册申报问题解析

人EGFR突变基因检测试剂注册申报问题解析

【作 者】吴传松1，黄杰2，安娟娟1，邓刚1

1 国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心，北京市，100044 2 中国食品药品检定研究院，北京市，100050

肿瘤个体化治疗相关突变基因检测试剂快速发展，其中，人表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）突变基因检测作为肿瘤个体化治疗的分子靶标受到普遍关注。该文将通过对过往人EGFR突变基因检测试剂注册申报过程中存在的常见问题进行解析，阐述该类问题的解决办法，希望对从事该类产品注册申报的行业人员提供参考和帮助。

人表皮生长因子受体；突变基因

0 引言

人EGFR突变基因检测试剂主要是指基于位点特异荧光-核酸聚合酶链式反应（ARMS-PCR法）、基因测序方法等技术，以EGFR突变基因序列为检测目标，体外检测人体病理组织和/或外周血等样本。研究表明EGFR突变基因在多种肿瘤细胞中存在，这些突变基因是肿瘤患者是否对TKI敏感的预测因子且被认为是TKI治疗的有效预测指标[1]。EGFR突变基因主要发生在胞内酪氨酸激酶（TK）区域的前四个外显子上（18～21）[2]。随着一代EGFR-TKIs治疗药物的使用，也发现了一些可能的耐药突变，如发生在外显子20上的替代突变T790M[3-4]。针对这些耐药突变，目前也开发了一些新型药物，如针对T790M耐药的新药物等[5]。此外，还有许多类型的突变临床意义尚不明确。

1 人EGFR突变基因检测试剂注册审评现状

在我国，依据《体外诊断试剂注册管理办法》[6]关于产品分类的要求，该类产品按照第三类产品进行管理。在美国FDA，人EGFR突变基因检测试剂被归为体细胞突变基因检测系统，按照上市前审批（PMA）管理。目前我国该类上市产品已有十几家。检测人EGFR突变基因的方法学主要有位点特异PCR荧光探针法、基因测序法、数字PCR法等，不同方法学之间在检测性能方面也存在明显差异[7-10]。

2 人EGFR突变基因检测试剂申报过程中常见问题

2.1 人EGFR突变基因检测试剂说明书预期用途

目前申报该类产品说明书中存在预期用途指向不明确，表述不清晰等问题。申请人需规范预期用途表述形式，结合该类产品临床评价数据与个体化诊疗药物联合治疗情况客观描述产品预期用途。依据《体外诊断试剂产品说明书指导原则》要求，预期用途需明确该类型产品样本类型，生物学标志物，定性或定量等内容。申请人需规范EGFR不同突变基因型别表达形式，明确产品外显子、突变位点、cosmic代码等信息。

申请人需针对自身完成的药物诊疗个体化伴随检测研究工作，明确申报产品是否联合伴随药物进行联合临床研究。对于申报试剂伴随具体治疗药物联合进行临床试验研究，并证明两者伴随使用具有显著的临床治疗意义，需在说明书中明确具体药物及生产企业，并简要介绍相关临床患者受益情况。如靶基因突变与肿瘤疾病及治疗方案的相关性描述来自治疗指南、书籍、文献等资料，则在本项下注明参考资料的出处。

产品说明书预期用途中，申请人需对EGFR突变基因检测进行临床背景介绍，包括检测相关适用人群特征、肿瘤组织样本类型、EGFR突变基因序列相关信息，EGFR突变基因及其表达蛋白在非小细胞肺癌发生、发展过程中可能起到作用，相关药物或其他治疗技术及其作用机理、与待测突变位点可能存在关系等[11]。

2.2 人EGFR突变基因检测试剂临床研究

研究表明[12]，EGFR突变基因被检测人群之间存在种族差异。亚裔人群中非小细胞癌患者EGFR突变基因阳性率明显高于高加索人群EGFR突变基因阳性率。但目前我国人群肿瘤突变基因数据库相对缺乏，无论是境外申请人还是境内申请人进行人EGFR突变基因检测试剂注册申报前均需完成我国境内临床研究资料，满足《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》要求，且每种基因型需完成一定病例数的阳性样本。尽管人EGFR常见敏感突变基因在肺腺癌中是EGFR-TKIs的阳性预测标志物，但罕见EGFR突变基因流行病学以及对预后和TKIs疗效的影响是未知的[13]。在临床试验过程中，如申报产品中部分突变基因类型未在非小细胞肺癌人群中检出，可能与该部分突变基因在我国人群突变频率较低或总样本人群选择存在偏倚有关。针对该类问题，建议申请人扩大临床样本人群或根据不同突变基因突变频率特点，增加不同地域的临床研究机构，提高这部分突变基因阳性检出率。

2.3 人EGFR突变基因检测试剂检测人外周血样本

目前申报产品中最为常见的样本类型以中性福尔马林固定石蜡包埋病理组织(FFPF)为主，且FFPF是获取肿瘤突变基因信息的主要方式，但大部分晚期非小细胞肺癌患者已失去手术机会或因其他原因不能获取肿瘤FFPF样本。研究结果表明，随着肿瘤细胞的凋亡，肿瘤游离DNA（ctDNA）片段释放到人体血液循环中，通过对外周血肿瘤游离DNA的检测解读，可以更好地了解肿瘤病情的发展情况以及寻找适合的治疗方案，尤其对于那些无法通过手术取得肿瘤组织或希望在治疗后对病情进行跟踪随访的人群，是一种理想和有效的检测手段。病理组织和外周血样本相比，主要相同点在于临床肺癌晚期病人中采集同源性病理组织样本和外周血样本均能检测EGFR突变基因。但由于血液游离DNA含量及变异情况会随着肿瘤病情的发展、转移性肿瘤的发生、以及用药治疗情况发生实时的变化，外周血检测EGFR突变基因检测结果存在一定的不确定性。两种样本在用于人肺癌的分子靶向治疗（EGFR-TKI）治疗效果也存在差异。

鉴于上述原因，人EGFR突变基因检测试剂如适用于外周血样本检测人群，预期用途需限定为晚期非小细胞肺癌（NSCLC）样本患者，且作为不能获取NSCLC样本时的补充手段。鉴于病理组织样本和外周血样本中EGFR突变基因比例不同，申报产品需分别满足检测外周血样本和病例组织样本最低检出限要求。

2.4 人EGFR突变基因检测试剂适用样本采集储存

病理组织样本需详细介绍组织学样本类型，包括样本来源及取材要求、组织标本采集厚度、样本处理方式（如组织样本的固定及包埋方式）、肿瘤细胞比例等。在进行核酸序列检测前，需对用于肿瘤组织突变基因检测的标本进行确认，并富集可能存在突变基因的肿瘤细胞。肿瘤细胞所占比例需达到所用扩增检测方法的要求。

外周血样本采集后，需规定外周血样本存放条件以及对存放时限及温度设置等进行验证，包括采用加入抗核酸降解的采血管要求。样本采集管保存管中所用的防腐剂、抗凝剂、保护剂等辅助成分不应对基因序列扩增产生干扰。血液通常需要先进行抗凝保存，抗凝剂的选择很重要。申请人需对抗凝剂、防腐剂、保护剂等成分进行验证。

因晚期肺癌患者外周血样本中EGFR突变基因含量相对较少，建议增加外周血样本提取总量和采取相应富集的方式进行核酸提取纯化。从而保证外周血样本中EGFR基因片段被提取的机率增大。同时，需保证核酸提取工艺，减少核酸损耗和降解。申请人需对外周血全血保存时间及温度，离心参数设置等进行验证。因ctDNA含量低，为提高EGFR突变基因检出率，在患者身体条件允许的情况下，推荐增加血浆采集量。抽血后需尽快分离血浆，延迟血浆分离将导致血液中血细胞的裂解，释放出大量人基因组DNA（gDNA）至血浆中；增加的gDNA会稀释肿瘤细胞来源的ctDNA，使得突变基因难以检出。因此，在外周血标本收集、运输及贮存过程中，需有效避免游离DNA降解；同时，还需防止血液中白细胞裂解，避免因野生型游离DNA增加导致ctDNA中EGFR突变基因比例变小，可能导致EGFR突变基因检测结果假阴性[14]。

2.5 人EGFR突变基因试剂注册申报中其他常见问题

2.5.1 人EGFR突变基因检测试剂产品技术要求

申请人在设置企业内部参考品时，因考虑不同样本类型之间存在的差异情况，根据不同样本类型及突变基因型分别设置企业内部参考品。申请人在制定产品技术要求时，也需考虑不同样本类型及不同突变基因型的性能评价要求和检验方法。

2.5.2 申请样本类型许可事项变更事项

如申请人在人EGFR注册产品原有病理组织样本检测基础上增加外周血样本类型，申请人需考虑外周血样本类型与病理组织样本类型中人EGFR突变基因片段长度，样本中EGFR突变基因比例等差异。申请人需依据法规要求提交适用样本变更申报资料，同时还需提交申报试剂扩增反应体系性能研究、适用于外周血样本的人EGFR突变基因检测试剂分析性能评价、外周血样本保存及处理等研究资料。

3 结论

人EGFR突变基因检测目前是EGFR-TKIs治疗的重要检测靶点，随着核酸检测技术的发展，如：BEAMing技术、数字PCR、高通量测序技术运用于肿瘤个体化治疗相关突变基因检测越来越受到临床专家和行业研究人员的关注。面对目前临床常规成熟且推荐的检测技术，新的检测技术如何定位。临床个体化应用与临床个体化研究两者存在差异，临床转化医学研究如何有效转化为临床应用，都将是今后注册审评关注重点。产品使用过程中也不能忽视操作人员对检测结果影响。从样本采集及预处理、检测过程中防污染措施、检测结果多因素分析等，都需要有经验的专业人员操作。因此，对操作人员的相关培训不能忽视。希望通过本文对人EGFR突变基因检测试剂申报过程中常见问题的梳理，帮助申请人减少注册申报资料中的问题，提升该类产品注册申报资料质量。

[1] 高云, 陈嘉昌, 朱振宇, 等. EGFR基因突变及其检测方法的研究进展[J]. 分子诊断与治疗杂志, 2011(3): 51-57.

[2] 张铁梅. EGFR突变状态对NSCLC预后的影响[D]. 天津: 天津医科大学, 2013.

[3] Rosell R, Molina M A, Costa C, et al. Pretreatment EGFR T790M mutation and BRCA1 mRNA expression in erlotinibtreated advanced non-small-cell lung cancer patients with EGFR mutations[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17: 1160-1168.

[4] Balak M N, Gong Y, Riely G J, et al. Novel D761Y and common secondary T790M mutations in epidermal growth factor receptormutant lung adenocarcinomas with acquired resistance to kinase inhibitors[J]. Clin Cancer Res, 2006, 12: 6494-6501.

[5] Zhou W, Ercan D, Janne PA, Gray NS. Discovery of selective irreversible inhibitors for EGFR-T790M[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2011, 21: 638-643.

[6] 国家食品药品监督管理总局. 体外诊断试剂注册管理办法[R].国食药监械[2014]5号.

[7] Ishii H, Azuma K,Sakai K, et al. Digital PCR analysis of plasma cell-free DNA for non-invasivedetection of drug resistance mechanisms in EGFR mutant NSCLC: Correlation withpaired tumor samples[J]. Oncotarget, 2015, 6(31): 30850-30858.

[8] Hagemann I S, Devarakonda S, Lockwood C M. Clinical nextgeneration sequencing in patients with non-small cell lung cancer[J]. Cancer, 2015, 121(4): 631-639.

[9] 支修益, 胡牧, 王鑫. NGS技术检测中国原发性肺癌患者的EGFR、KRAS、BRAF和PIK3CA基因突变[J]. 中国医学前沿杂志（电子版）, 2015(2): 6-10.

[10] Zhao J, Zhao J, Huang J, et al. A novel method for detection of mutation in epidermal growth factor receptor[J]. Lung Canc (Amsterdam, Netherlands) , 2011, 74:226-232.

[11]国家食品药品监督管理总局. 肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂技术审查指导原则[EB/OL]. (2014-03-13)[ 2016-9-26]. http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1421/97704.html.

[12]中国医师协会肿瘤医师分会, 中国抗癌协会肿瘤临床化疗专业委员会. 中国表皮生长因子受体基因敏感突变和间变淋巴瘤激酶融合基因阳性非小细胞肺癌诊断治疗指南(2014版)[J]. 中华肿瘤杂志, 2014, 36(7): 555-557.

[13] Lohinai Z, Hoda M A, Fabian K, et al. Distinct epidemiology and clinical consequence of classic versus rare EGFR mutations in lung adenocarcinoma[J]. J Thorac Oncol, 2015, 10(5): 738-746.

[14]《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》制定专家组. 非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识[J]. 中华医学杂志, 2015, 95(46): 3721-3726.

Resolved Problems of EGFR Mutation Detection Reagent Registration Application

【 Writers 】WU Chuansong1, HUANG Jie2, AN Juanjuan1, DENG Gang1
1 Center for Medical Devices Evaluation of CFDA, Beijing, 100044 2 National Institute for Food and Drug Control, Beijing, 100050

human epidermal growth factor receptor, gene mutation

widespread attention. In this paper, through analyzing the common problems of human EGFR gene mutation detection reagent present during the past registration application. This paper describes a solution of such problems. We hope to provide information and help for relevant personnel engaged in such products registration application.

1671-7104(2017)04-0289-03

2016-11-25

吴传松，E-mail: cswu2010@126.com

F203；R362

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2017.04.015

【 Abstract 】Cancer treatment-related gene mutation detection reagent develops rapidly especially, human Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) gene mutation as a molecular target for cancer therapy has