由组织培养实验失败而进行的反思性探究教学

朱慧娟

在组织培养的实验中，笔者带学生做了植物组织培养的实验，学生在后续观察中，发现实验效果不理想，培养基污染严重（见图1）。笔者本想通过科学实验来激励学生的探究热情，结果却换来班上学生的一片叹息。看着学生那失望和惋惜的眼神，感觉学生信心受了打击，笔者决定要找出实验失败的原因。

带领学生观察已污染的培养基后，教师将学生再次带到组织培养实验室，回顾整个组织培养过程，试图和学生一起找出实验失败的原因，并对实验进行改进。

1 寻找污染的各种可能原因

1.1 回顾实验操作

让学生复述实验操作，也以此检验学生对实验流程的掌握程度。总结如下。

1.1.1 实验前准备

（1）进入实验室前换鞋，并换上已消毒的白大褂。将接种室和超净工作台紫外灯提前20 min全部打开，将风机全部打开，阻止外部气体进入接种室内部。

（2）配置培养基：在配制培养基时，用的是MS培养基，用超纯水溶解。为了防止焦糊，将小火间断加热改为在微波炉中用中火加热5～6 min，配制过程如图2所示。

（3）高压蒸汽灭菌：培养基分装到培养瓶后，用高压蒸汽灭菌锅保持0.1～0.15 kPa（温度121 ℃）的高压状态灭菌30 min。灭菌过程如图3所示。

1.1.2 实验过程

（1）取外植体（菊花叶）：校植物园内有菊花，采新鲜的菊花茎若干。

（2）消毒：将采集的菊花茎先在70%酒精中浸泡10 s后用无菌水冲洗，然后用2.0%次氯酸钠溶液消毒15 min，最后再用无菌水冲洗。具体过程如图4所示。

（3）接种：进入接种室，在超净工作台上将已消毒的菊花茎剪成若干段（剪子和镊子都已事先高温灼烧灭菌），取一段菊花茎接种在已灭菌冷却的培养基上，如图5所示。

（4）贴上标签，置于光照培养箱中培养，温度控制在18～22 ℃，如图6所示。

1.2 引导学生分析造成污染的原因

针对学生回忆出的实验步骤，教师播放实验时拍摄的照片和视频，让学生自己去分析每一个步骤可能造成微生物污染的原因。总结如下。

1.2.1 接种和培养环境不清洁

尽管事先接种室和超净工作台的紫外灯全部都已打开，有学生提出可能由于人多，进入实验室后，粘在人身体上的各种微生物被带入到接种室和培养室。

1.2.2 培养基及各种使用器具灭菌不彻底

由于实验时间有限，而高压蒸汽灭菌整个步骤耗时将近30 min，为了学生能在有限时间完成整个实验操作流程，通常采取的是用一个高压蒸汽灭菌锅灭菌，在等待灭菌的时间里继续进行下一个步骤，这样就要求教师提前用另一高压蒸汽灭菌锅去准备好已灭菌过的冷却了的培养基，冷凝的空气可能滴入培养瓶盖上，造成污染。也有的同学根据课本提示指出在灭菌过程中，可能没有排净锅内冷空气。锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。还有同学认为灭菌所需时间达到后，切断电源，让灭菌锅自然降温，当压力表的压力降至零时，才能打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，可能是压力未降到零时，就打开了排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的液体由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

1.2.3 外植体消毒不彻底

由于实验是在校园内取材，外植体上的微生物众多，需要彻底消毒。但是考虑到氯化汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，为防止学生中毒，所以教学中并没有选用氯化汞，消毒时选用体积分数为70%酒精浸泡10 s，然后用1.0%次氯酸钠溶液消毒15 min。两次都应用无菌水冲洗，不过当时并没有无菌水，用超纯水替代，很多学生质疑，超纯水中可能含有细菌，造成了污染。

1.2.4 接种时没有严格要求无菌操作

可能接种时，学生的手没有消毒，碰到了外植体；也可能剪刀和镊子未放在灭菌器中灼烧灭菌。有的同学因白大褂数量不够，没有换掉外面的衣服，可能将附着在衣服上的外面的微生物带入实验室；还有的同学完全打开了超净工作台的玻璃门，将头伸进去，在培养瓶上方操作，可能头发碰到了培养基，如图7所示。

通过对照片和视频进行分析，学生理解了规范操作的重要性，也为后面学习微生物的培养实验奠定了基础。

2 通过对照试验，排除部分因素，进一步确定可能因素

在实验室对每个培养瓶检查后，有位学生发现自己在同一时间同一地点用相同批次灭菌过的培养基接种的不同种类外植体生长情况不同。一瓶接种的是校园内取材的菊花茎，另一瓶接种的是在实验室取材的烟草。在组织培养室中教师提前已经做了很多烟草叶的组织培养，部分同学因为好奇，自己也接种了一瓶。接种菊花茎的已经被污染，而接种烟草的生长良好，没有污染物，如图8所示。

该学生提出，问题可能不在培养基上，主要还是外植体的消毒上。可能是消毒时间太短，还有可能是要严格用无菌水冲洗，而不能用超纯水。教师反问学生，“顾名思义，无菌水就是将水中微生物杀死而得到的水，你觉得如何得到无菌水呢？”有学生受到高压蒸汽灭菌的思路引导，提出无菌水可用自来水经过高温杀菌制作而成。将水加入三角瓶中，加棉塞、包扎、高压灭菌，与培养基的灭菌原理相同。

3 通过图片和材料分析，推测污染物成分

很多学生发现不同培养瓶中污染物的成分不同，有的污染物是黑色的，有的污染物是红色的，有的污染物是白色的。学生提问：“这究竟是什么生物呢？是细菌还是真菌？”

教师提供信息：细菌菌落较小，形状表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多为白色；真菌落较大，菌丝细长，菌落疏松，呈绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状，无固定大小，多有光泽，不易挑，有时还呈现红色、褐色、绿色、黑色、黄色等不同的颜色（孢子的颜色）。看菌落一般大致可以分辨出细菌和真菌，若通过菌落分辨不出，就需要用显微镜镜检。学生根据笔者刚才提供的信息指出污染物大多是真菌，最常见的污染就是霉菌。为了验证学生的推论，笔者建议学生用镊子取各微生物放在滴加清水的载玻片中，涂匀后盖上盖玻片，做成临时装片在显微镜下观察，如图9所示，霉菌的特点是有许多分生孢子，如图10所示，看看是否能在显微镜下找到。

学生通过菌落与显微镜的观察，得出污染物绝大多数为真菌，少部分为细菌。

4 对实验进行改进，并预设各种可能

通过对现象的分析，大家找到了许多可能造成污染的原因，最可能的原因就是外植体消毒不彻底。接下来，将实验中的所有不规范的操作全部改正，严格按实验规范来操作。如果说第一次实验仅仅是为了从知识层面上让学生对该实验的具体操作和高压蒸汽灭菌的原理有所了解，那么后来的改进实验就是为了让学生在情感上有所收获：要正视科学实验，科学是容不得一点马虎的，从而培养学生从小形成既求真务实又开拓创新的科学态度。

5 重做实验，每天观察和分析

班级学生人数太多时，班级实验难以开展，很多操作不能一一指导。接下来，分批让学生重做实验。严格按要求对外植体进行消毒，并用无菌水冲洗。当然实验也可能还有失败的，需要继续探讨原因并及时进行改进。

收稿日期：2016-10-30