响应面法优化泰妙菌素生产菌株原生质体再生培养基

孙金刚，杨 智，牛 春，张 萍

(宁夏泰瑞制药股份有限公司，宁夏银川 750101)



响应面法优化泰妙菌素生产菌株原生质体再生培养基

孙金刚，杨 智，牛 春，张 萍*

(宁夏泰瑞制药股份有限公司，宁夏银川 750101)

[目的]采用响应面法对泰妙菌素生产菌株原生质体的再生培养基进行优化。[方法]利用Minitab统计软件，采用中心复合响应面设计对泰妙菌素生产菌株原生质体再生培养基的琼脂浓度和蔗糖浓度进行了优化。[结果]泰妙菌素生产菌株原生质体的再生培养基优化为马铃薯20.00%(浸提液)+葡萄糖2.00%+蔗糖2.70%+琼脂1.56%，pH=6.5。优化后的再生培养基的单菌落复苏率由0.7‰提高到3.5‰。[结论]该研究可为泰妙菌素的研发奠定基础。

响应面法；泰妙菌素；原生质体；再生培养基

延胡索酸泰妙菌素是新型兽用抗生素，抗菌谱广，对支原体、金黄色葡萄球菌、螺旋体等病原体具有抑制作用[1-5]，主要用于防治猪支原体肺炎和鸡慢性呼吸道疾病[2]。该药物是截短侧耳素的衍生物[6-7]。截短侧耳素由担子菌纲伞菌目斜盖伞属真菌产生，由于遗传背景资料少，目前常采用诱变育种的方式进行菌种选育研究[2, 8]。原生质体是诱变育种的良好材料，之前已经建立泰妙菌素生产菌株原生质体的制备方法，但再生率偏低。笔者采用响应面法对泰妙菌素生产菌株原生质体再生培养基进行了优化，以期为泰妙菌素的研发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。泰妙菌素生产菌(Clitopilusprunulus)，批号TMII14-28，由宁夏泰瑞制药股份有限公司菌种研究室保藏。

1.1.2 仪器与设备。LDZX-75KBS立式蒸汽压力灭菌器(上海申安医疗器械厂)、YT-CJ-2N双人双面净化工作台(北京亚泰科隆仪器技术有限公司)、HZQ-F280全温振荡培养箱(太仓市华美生化仪器厂)、PSX智能型恒温恒湿培养箱(宁波莱福科技有限公司)。

1.1.3 培养基。种瓶培养基为马铃薯20%(浸提液)、葡萄糖2%，pH=6.5。初始原生质体再生培养基为马铃薯20%(浸提液)、葡萄糖2%、琼脂2%，pH=6.5。

1.2 方法

1.2.1 原生质体的制备。取培养3 d的种子液20 mL，3 000 r/min下离心10 min后收集菌丝。将过滤除菌的酶液20 mL加入到上述菌丝中，25 ℃条件下酶解3.0～3.5 h，每隔0.5 h振荡混匀1次。最后,用G2砂芯漏斗过滤，收集滤液。用缓冲液将滤液稀释10倍后，每个培养皿均匀涂布200 μL。

1.2.2 原生质体计数。原生质体采用血球计数板计数。

1.2.3 响应面法优化试验。在前期单因素试验结果的基础上，确定蔗糖、琼脂为关键因素。以蔗糖浓度、琼脂浓度和葡萄糖浓度为自变量，以复苏的单菌落数量为响应值，进行响应面试验设计。响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平

2 结果与分析

响应面试验结果见表2。 对表2中复苏的单菌落数量进行多元回归拟合，得到二次回归方程：Y=-2.45+1.88×A+0.92×B+5.34×C-0.78×AB+0.23AC+10.23BC-0.12×A2+1.89×B2-18.45×C2。二次多项式模型中复苏的单菌落数量与蔗糖浓度、琼脂浓度和葡萄糖浓度具有极显著相关(P<0.01)，拟合检验非常显著。其中，蔗糖浓度对复苏的单菌落数量有极显著影响(P<0.001)，琼脂浓度对复苏的单菌落数量有极显著影响(P<0.001)，其校正决定系数为0.878 5，说明此模型拟合度良好。

利用Minitab统计软件，采用中心复合响应面设计制定试验方案，对原生质体再生培养基的琼脂浓度和蔗糖浓度进行了优化，优化结果见表3。方差分析表明，R2=0.999 96，从图1可以看出，复苏的单菌落数量随着蔗糖浓度的增加而降低，而复苏的单菌落数量随着琼脂浓度的增加呈先升高后降低的趋势，当蔗糖浓度为1.5%时复苏的单菌落数量达到最大，说明蔗糖浓度与琼脂浓度对复苏的单菌落数量影响显著，与前期单因素试验结果相一致。

表2 响应面试验设计与结果

表明该二次回归方程模型与试验结果的符合度达99.99%，说明二次回归方程与模型有很高的可信度。

由图2可知，预测的最优琼脂浓度与蔗糖浓度分别为1.56%和2.70%。根据优化后的配方进行回归模型试验验证，结果表明优化后的再生培养基单菌落复苏率由0.7‰提高到3.5‰，提高了5倍。

3 讨论与结论

在再生培养基中添加一定浓度的蔗糖可以提高泰妙菌素生产菌株的原生质体再生率，其原因可能是添加蔗糖有助于原生质体维持渗透平衡，防止细胞死亡。琼脂浓度会影响营养物质的利用速率，通过优化再生培养基的琼脂浓度也能够提高再生率[9-10]。

表3 原生质体再生培养基中琼脂浓度和蔗糖浓度的优化

图1 响应面试验结果 Table 1 The results of response surface test

笔者采用响应面法对泰妙菌素生产菌株原生质体的再生培养基中的琼脂浓度和蔗糖浓度进行了优化，确定泰妙原生质体再生培养基为马铃薯20.00%(浸提液)+葡萄糖

图2 响应面优化器预测 Table 2 The prediction of response surface test

2.00%+蔗糖2.70%+琼脂1.56%，pH=6.5。优化后的再生培养基单菌落复苏率由0.7‰提高到3.5‰，提高了5倍。

[1] 王学红,梁剑平,赵晓彬,等.高产截短侧耳素产生菌高通量筛选方法的建立[J].中国兽医学报，2013，33(10):1590-1594.

[2] 黄贺贤,曾振灵,黄显会.截短侧耳素类抗生素——泰妙菌素的研究进展[J].中国兽药杂志，2010，44(6):42-45.

[3] KAVANAGH F,HERVEY A,ROBBINS W J.Antibiotic substances from basidiomycetes:Ⅷ.Pleurotusmultilus(Fr.) Sacc.andPleurotuspasseckerianusPilat[J].Proc Natl Acad Sci USA,1951,37(9):570-574.

[4] LABER G.Activity of various compounds against a pathogenic strain ofTr-

eponemahyodysenteriae[J].Zentralbl Bakteriol Orig A，1976，236(1):127-130.

[5] DAUM R S，KAR S，KIRKPATRICK P.Fresh from the pipeline:Retapamulin[J].Nat Rev Drug Discov，2007，6(11):865-866.

[6] 杨冠洲 ,尚若锋.截短侧耳素类化合物的研究进展[J].南方农业学报，2015，46(8):1527-1532.

[7] 汤有志,远立国,刘雅红.截短侧耳素类抗生素的研究进展[J].中国兽医杂志，2012，48(5):65-68.

[8] 冉茜.基于响应面方法优化截短侧耳素发酵产量[D].重庆：西南大学，2009.

[9] 刘卫东,苏浩,虞星炬.培养基琼脂浓度及抗生素对3种海洋微藻生长的影响[J].生物技术，2006，16(6):75-77.

[10] 梅传生,张金渝,汤日圣,等.琼脂浓度对水稻愈伤组织植株再生率和内源激素含量的影响[J].中国水稻科学，1993，7(3):148-152.

Optimization of Protoplast Regeneration Medium for the Producing Bacteria of Tiamulin by Using Response Surface Methodology

SUN Jin-gang, YANG Zhi, NIU Chun, ZHANG Ping*

(Ningxia Tairui Pharmaceutical Co., Ltd., Yinchuan, Ningxia 750101)

[Objective] To optimize the regeneration medium of protoplast for the producing bacteria of tiamulin by using response surface methodology. [Method] The concentrations of agar and sucrose in the regeneration medium of protoplast for the producing bacteria of tiamulin were optimized by using central composite response surface design and Minitab software. [Result] The regeneration medium of protoplast for the producing bacteria of tiamulin was optimized as 20.00% potato extract +2.00% glucose + 2.70% sucrose + 1.56% agar, pH=6.5. The regeneration rate of recovered colony increased from 0.7‰ to 3.5‰. [Conclusion] The research can lay the foundation for the development and research of tiamulin.

Response surface methodology; Tiamulin; Protoplast; Regeneration medium

孙金刚(1988- )，男，宁夏德隆人，从事菌种选育研究。 *通讯作者，高级工程师，从事菌种及微生物发酵研究。

2016-10-26

S859.79+6

A

0517-6611(2016)36-0149-02