解脲支原体感染动物模型优化方案研究

刘文娥，张婉妮，周 意，王 剑

(1.湖南中医药大学第一附属医院 妇产科，长沙 41007;2.湖南中医药大学2008级七年制研究生班，长沙 410007; 3.湖南中医药大学2009级七年制研究生班，长沙 410007)

解脲支原体感染动物模型优化方案研究

刘文娥1，张婉妮2，周 意3，王 剑1

(1.湖南中医药大学第一附属医院 妇产科，长沙 41007;2.湖南中医药大学2008级七年制研究生班，长沙 410007; 3.湖南中医药大学2009级七年制研究生班，长沙 410007)

目的探索不同造模方法的优劣性，选择最合适的解脲支原体感染动物模型方法。方法选择SPF级BALB/c雌性小鼠、Wistar大鼠，分别以小剂量UU3菌液多次感染、大剂量UU3菌液一次感染、苯甲酸雌二醇预处理为干预措施，建立解脲支原体感染动物模型，分别于首次接种后14 d、28 d、42 d、56 d取实验动物宫颈分泌物行解脲支原体培养，取生殖器做形态学分析。结果①BALB/c小鼠与Wistar大鼠相比，BALB/c小鼠总体一般情况较差，阴道分泌物增加，外阴溃烂明显，而Wistar大鼠外阴无明显变化。②大鼠各组阴道UU定植率比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05);小剂量雌激素组与小剂量非雌激素组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);大剂量雌激素组与大剂量非雌激素组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);小剂量雌激素组与大剂量雌激素组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);小剂量非雌激素组与大剂量非雌激素组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。小鼠各组结果同大鼠。③同样干预措施，在小剂量雌激素处理下，大、小鼠比较，差异有统计学意义(P＜0.05);在大剂量雌激素处理下，大、小鼠比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明同等处理措施下小鼠阴道UU定植率更高。④肉眼观:小剂量雌激素组个别大鼠生殖道组织有水肿，其余各组大鼠生殖道组织柔软，活动度好;空白组小鼠生殖道组织柔软，活动度好;小剂量雌激素组小鼠生殖道组织充血明显，输卵管积水，增粗，僵硬，弹性差;大剂量雌激素组小鼠以疏松水肿为主;小剂量非雌激素组和大剂量非雌激素组仅见阴道、宫颈轻度充血水肿。⑤镜下观:大鼠各干预组阴道组织无明显病理损伤，部分可见疏松组织水肿。小剂量雌激素组小鼠病理损伤严重;小剂量非雌激素小鼠组、大剂量雌激素小鼠组充血水肿程度较轻，腺体轻度扩张，炎性分泌物较多。结论BALB/c小鼠与Wistar大鼠相比，外阴损伤明显;雌激素预处理能增加实验动物解脲支原体的定植率;小剂量多次感染比大剂量一次感染更能增加UU定值率;UU在BALB/c小鼠阴道UU定植率更高;BALB/c小鼠病理损伤严重，对动物实验研究价值更大。

解脲支原体;动物模型;大鼠;小鼠;优化方案

解脲支原体(Ureaplasma urealyticum，UU)是女性生殖道常见的一种支原体，它既可以是寄生菌，也可以是致病菌。女性生殖道解脲支原 体可正常存在，不一定发病［1，2］，当女性生殖道免疫力下降或黏膜受损时，潜伏在生殖道的UU便可大量繁殖而致病。UU在性传播疾病中发病率很高，不仅可引起前庭大腺炎、阴道炎［3，4］、宫颈炎［5］等下生殖道感染，也可引起子宫内膜炎、输卵管炎、输卵管积水、卵巢囊肿等上生殖道感染［6，7］，导致不孕不育［8］、异位妊娠［9］及胎儿宫内感染、流产等［10，11］，严重影响女性的生殖健康和生活质量。本文通过对解脲支原体感染的不同造模方法进行优劣比较，探索最合适的造模方法，为今后更深入的实验研究打下基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:BALB/c雌性小鼠40只，8周龄，体重(20±2)g，SPF级;购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产证号:SCXK(湘)2011-0003，Wistar雌性大鼠 20只，12～15周龄，体重(180～220)g，SPF级。购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产证号:SCXK(湘)2011-0003，使用许可证编号:SYXK(湘)2013-0005。阴道分泌物支原体培养阴性，排除既往感染。

1.1.2 实验药物:苯甲酸雌二醇注射液:4 mg/mL，苏州市苏牧动物药业有限公司生产，批号: (2012)100862511。

1.1.3 UU菌株:UU3型，由南华大学微生物学与免疫学教研室提供。

1.1.4 主要试剂:UU液体培养基:2 mL/支，由珠海银科生物工程有限公司生产。

1.1.5 主要仪器:37℃恒温箱、HB-100煮锅、超净工作台、低温冰箱、石蜡包埋机、石蜡切片机、生物组织摊片机、全封闭自动脱水机、电子分析天平、台式高速离心机、移液器、光学显微镜、高清晰度彩色病理分析系统、烧杯、量桶、眼科剪、镊子、组织剪、组织钳、止血钳等。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组:将实验动物饲养于屏障设施中，适应环境1周。将所有动物称重，按随机数字表法将大、小鼠分别随机分为5组:空白组、小剂量雌激素组、小剂量非雌激素组、大剂量雌激素组、大剂量非雌激素组，小鼠每组8只，大鼠每组4只。

1.2.2 实验动物预处理:将小剂量雌激素组、大剂量雌激素组于菌液接种前颈部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/只，每周1次，连续4周。其余各组动物颈部皮下注射无菌生理盐水。

1.2.3 UU3菌液制备:将冻干 UU3标准株加入2 mL UU培养基内，充分混匀。取3支高温处理的无菌小试管，分别加入2 mL培养液和UU3标准混悬液2滴，置于37℃恒温培养箱中培养增菌，当培养液颜色由黄色变为玫瑰红色时取出，增菌产物予液体培养基稀释配制成浓度为105CCU/mL、107CCU/ mL的菌液。

1.2.4 造模方法:于第2次预处理后第2天开始菌液接种。采用移液枪和一次性枪头，暴露实验动物阴道，将浓度为105CCU/mL的菌液50 μL注入小剂量雌激素组、小剂量非雌激素组，每天1次，连续7 d;将浓度为107CCU/mL的菌液50 μL注入大剂量雌激素组、大剂量非雌激素组，仅注入1次;空白组阴道内注入等量无菌培养基。菌液接种后，将实验动物倒立5～10 min，待菌液被阴道黏膜完全吸收后，放回笼内。

1.2.5 检测指标:

1.2.5.1 一般情况观察:观察及记录各组动物的活动度、饮食、毛发、外阴、阴道分泌物、二便等情况。

1.2.5.2 阴道分泌物UU培养法:分别于首次接种后7、14、21、28、35、42、49、56 d取实验动物阴道分泌物行解脲支原体培养。以无菌阴拭子取实验动物阴道分泌物，将阴拭子插入动物阴道内，轻轻旋转蘸取阴道分泌物，然后将阴拭子置于2 mL UU无菌培养基内，充分吹打混匀，盖好橡皮塞，置于37℃恒温培养箱中培养24～48 h，观察颜色变化，当培养基颜色由黄色变成红色时，提示有UU生长。

1.2.5.3 组织形态学观察:分别于首次接种后14、28、42、56 d分4批以颈椎脱臼法处死动物(小鼠每组每批处死2只，大鼠每组每批处死1只)，肉眼观察实验动物的阴道、宫颈、子宫、输卵管等组织;取实验动物阴道组织，甲醛固定，二甲苯透明浸腊，石蜡包埋，切片，HE染色后，光镜下行形态学分析。

1.2.6 统计学方法:采用 SPSS 19.0统计学软件，组间数据比较采用卡方检验。

2 结果

2.1 实验动物一般情况观察

Wistar大鼠各组外阴情况:正常组大鼠:毛发白，毛色光滑，无竖毛，外阴正常，阴道口无明显扩张，阴道分泌物无明显增加。大、小剂量非雌激素组大鼠:毛发白，毛色光滑，无竖毛，外阴正常，阴道口无明显扩张，阴道分泌物无明显增加。大、小剂量雌激素组大鼠:毛发白，毛色光滑，无竖毛，外阴无红肿溃烂，阴道口稍扩张，阴道分泌物增加(图1)。

BALB/c小鼠各组外阴情况:正常组小鼠:毛发白，毛色光滑，无竖毛，外阴正常，阴道口无明显扩张，阴道分泌物无明显增加。大、小剂量非雌激素组小鼠:毛发稍发黄，无竖毛，外阴红肿，部分溃烂，面积较小，阴道口稍扩张，阴道分泌物增加。大、小剂量雌激素组小鼠:毛发发黄，竖毛，外阴红肿，外阴溃烂明显，溃烂面积大，阴道分泌物明显增加(图2)。

图1 各组大鼠外阴的外观。由左至右分别是正常组、小剂量雌激素组、小剂量非雌激素组、大剂量雌激素组、大剂量非雌激素组。Fig.1 Gross appearance of the vulva of Wistar rats in each group.From left to right:the normal group，low-dose estrogen group，low-dose non-estrogen group，high-dose estrogen group，high-dose non-estrogen group.

图2 各组BALB/c小鼠外阴的外观。由左至右分别是:正常组、小剂量雌激素组、小剂量非雌激素组、大剂量雌激素组、大剂量非雌激素组。Fig.2 Gross appearance of the vulva of the BALB/c mice in each group.From left to right:the normal group，low-dose estrogen group，low-dose non-estrogen group，high-dose estrogen group，high-dose non-estrogen group.

根据实验动物一般情况分析，雌激素预处理可以使实验动物阴道扩张，阴道分泌物增加，加重损伤程度;Wistar大鼠与 BALB/c小鼠相比，BALB/c小鼠一般情况较差，阴道分泌物增加，外阴溃烂明显，而Wistar大鼠外阴无明显变化。

2.2 解脲支原体感染检测结果

分别于首次接种后7、14、21、28、35、42、49、56 d取实验动物阴道分泌物行解脲支原体培养。将每次检测数据累加后，采用卡方检验进行统计学分析。

采用卡方检验进行数据分析，各组比较差异均具有统计学意义(P=0.000＜0.01)。小剂量雌激素组与小剂量非雌激素组比较，P=0.006＜0.01，差异有统计学意义;大剂量雌激素组与大剂量非雌激素组比较，P=0.000＜0.01，差异有统计学意义，说明雌激素预处理能增加大鼠阴道定植率。小剂量雌激素组与大剂量雌激素组比较，P=0.006＜0.01，差异有统计学意义;小剂量非雌激素组与大剂量非雌激素组比较，P=0.006＜0.01，差异有统计学意义，说明小剂量多次感染比大剂量一次感染更能增加大鼠UU定值(表1)。

采用卡方检验进行数据分析，各组比较差异均具有统计学意义(P=0.000＜0.01)。小剂量雌激素组与小剂量非雌激素组比较，P=0.000＜0.01，差异有统计学意义;大剂量雌激素组与大剂量非雌激素组比较，P=0.000＜0.01，差异有统计学意义，说明雌激素预处理能增加小鼠阴道定植率。小剂量雌激素组与大剂量雌激素组比较，P=0.106＞0.05，差异无统计学意义;小剂量非雌激素组与大剂量非雌激素组比较，P=0.182＞0.05，差异无统计学意义，说明小剂量多次感染与大剂量一次感染对小鼠UU定值无影响。

同样干预措施下，对大鼠、小鼠进行统计学分析。小剂量雌激素处理下，大鼠、小鼠比较，P= 0.018＜0.05，差异有统计学意义;大剂量雌激素处理下，大小鼠比较，P=0.000＜0.01，差异有统计学意义，说明同等处理小鼠阴道UU定植率更高(表2)。

2.3 肉眼组织形态学观察

Wistar大鼠生殖道组织肉眼观:正常组大鼠:生殖道组织柔软，活动度好。大、小剂量非雌激素组大鼠:生殖道组织柔软，活动度好。大剂量雌激素组大鼠:生殖道组织柔软，活动度好。小剂量雌激素组大鼠:个别大鼠生殖道组织有水肿，活动度欠佳(图3)。

BALB/c小鼠生殖道组织肉眼观:正常组小鼠:生殖道组织柔软，活动度好。大、小剂量非雌激素组小鼠:生殖道组织仅见阴道、宫颈轻度充血水肿。小剂量雌激素组小鼠:生殖道组织充血明显，输卵管积水，增粗，僵硬，弹性差。大剂量雌激素组小鼠:生殖道组织以疏松水肿为主(图4)。

2.4 镜下组织形态学观察

2.4.1 HE染色下Wistar大鼠阴道组织镜下观:空白组Wistar大鼠组、小剂量非雌激素 Wistar大鼠组、大剂量非雌激素 Wistar大鼠组、大剂量雌激素Wistar大鼠组阴道组织镜下观:阴道组织结构清晰，有少量炎症细胞浸润，上皮细胞角化部分脱落。小剂量雌激素组Wistar大鼠阴道组织镜下观:部分组织轻微病理损伤，炎性细胞浸润，部分可见疏松组织水肿(图5)。

表1 大鼠阴道分泌物解脲支原体感染情况Tab.1 Cases ofUreaplasma urealyticuminfection from the rat vaginal secretions

表2 小鼠阴道分泌物解脲支原体感染情况Tab.2 Cases ofUreaplasma urealyticuminfection from mouse vaginal secretions

2.4.2 HE染色下 BALB/c小鼠阴道组织镜下观:空白组BALB/c小鼠组:阴道组织结构清晰，有少量炎症细胞浸润，上皮细胞角化脱落不全。小剂量雌激素组BALB/c小鼠组:阴道组织充血水肿程度严重，炎性分泌物多，可见大量泡沫细胞浸润，可见大量脱落细胞及组织。小剂量非雌激素组BALB/c小鼠组:充血水肿程度较重，炎性分泌物较多，可见大量泡沫细胞浸润，可见大量脱落细胞及组织。大剂量雌激素BALB/c小鼠组:充血水肿程度较重，炎性分泌物较多，可见大量泡沫细胞浸润，可见大量脱落细胞及组织。大剂量非雌激素组BALB/c小鼠组:部分轻微病理损伤，炎性细胞浸润，部分可见疏松组织水肿(图6)。

2.4.3 HE染色下Wistar大鼠子宫组织镜下观:空白组Wistar大鼠组、小剂量非雌激素 Wistar大鼠组、大剂量非雌激素 Wistar大鼠组、大剂量雌激素Wistar大鼠组子宫组织镜下观:组织结构清晰，有少量炎症细胞浸润，腺体内可见均匀粉染的分泌物，上皮细胞角化不全或过度。小剂量雌激素组Wistar大鼠子宫组织镜下观:部分组织轻微病理损伤，炎性细胞浸润，部分可见疏松组织水肿(图7)。

图3 各组大鼠阴道、子宫、输卵管的外观。由左至右分别是:大鼠正常组、小剂量雌激素组、小剂量非雌激素组、大剂量雌激素组、大剂量非雌激素组。Fig.3 Gross appearance of the vagina，uterus and fallopian tube of Wistar rats in each group.From left to right: the normal group，low-dose estrogen group，low-dose non-estrogen group，high-dose estrogen group，high-dose non-estrogen group.

图4 BALB/c小鼠各组生殖器官肉眼观(由左至右分别是小鼠正常组、小剂量雌激素组、小剂量非雌激素组、大剂量雌激素组、大剂量非雌激素组)Fig.4 Gross appearance of the vagina，uterus and fallopian tube of the BALB/c mice in each group.From left to right: the normal group，low-dose estrogen group，low-dose non-estrogen group，high-dose estrogen group，high-dose non-estrogen group.

图5 HE染色下Wistar大鼠阴道组织镜下观(由左至右分别是大鼠正常组、小剂量雌激素组、小剂量非雌激素组、大剂量雌激素组、大剂量非雌激素组)放大倍数10×20Fig.5 Histology of the vagina of Wistar rats.From left to right:the normal group，low-dose estrogen group，low-dose non-estrogen group，high-dose estrogen group，high-dose non-estrogen group.

2.4.4 HE染色下 BALB/c小鼠子宫组织镜下观:空白组小鼠组:组织结构清晰，有少量炎症细胞浸润，腺体内可见均匀粉染的分泌物，上皮细胞角化不全或过度。小剂量雌激素组小鼠:粘膜、间质层不同程度中性粒细胞浸润，粘膜层、间质明显疏松水肿，子宫腺体扩张或增生，宫腔粘膜及粘膜下组织可见嗜酸性粒细胞及浆细胞浸润。小剂量非雌激素小鼠组:组织充血水肿程度较轻，腺体轻度扩张，炎性分泌物较多。大剂量非雌激素小鼠组:部分轻微病理损伤，炎性细胞浸润，部分可见疏松组织水肿。大剂量雌激素小鼠组:充血水肿程度较轻，腺体轻度扩张，炎性分泌物较多(图8)。

图6 HE染色下BALB/c小鼠阴道组织镜下观(由左至右分别是小鼠正常组、小剂量雌激素组、小剂量非雌激素组、大剂量雌激素组、大剂量非雌激素组)放大倍数10×20Fig.6 Histology of the BALB/c mouse vagina.HE staining.From left to right:the normal group，low-dose estrogen group，low-dose non-estrogen group，high-dose estrogen group，high-dose non-estrogen group.

图7 各组大鼠子宫的镜下形态。HE染色。自左至右:正常组、低剂量雌激素组、低剂量非雌激素组、高剂量雌激素组、高剂量非雌激素组。放大倍数10×20Fig.7 Histology of the rat uterus.HE staining.From left to right:the normal group，low-dose estrogen group，slow-dose non-estrogen group，high-dose estrogen group，high-dose non-estrogen group.

图8 HE染色下BALB/c小鼠子宫组织镜下观(由左至右分别是小鼠正常组、小剂量雌激素组、小剂量非雌激素组、大剂量雌激素组、大剂量非雌激素组)放大倍数10×20Fig.8 Histology of the BALB/c mouse uterus.HE staining.From left to right:the normal group，ow-dose estrogen group，low-dose non-estrogen group，high-dose estrogen group，high-dose non-estrogen group.

3 讨论

支原体是一类大小介于细菌和病毒之间、无细胞壁、呈多形性、能在无生命培养基中繁殖的原核微生物，常寄居在人体呼吸道和泌尿生殖道黏膜的表面，是引起女性泌尿生殖系统感染的常见病原体。寄居于人体泌尿生殖道粘膜的支原体以解脲支原体、人型支原体(Mycoplasma homonis，Mh)及生殖支原体(Mycoplasma genitalum，Mg)最常见，这3种支原体可正常存在于人体内，并不都致病，致病性支原体为特定血清型的支原体。UU是一类没有细胞壁的原核细胞微生物，界于细菌和病毒之间，归属柔膜体纲支原体目，是目前发现的能够在无生命体培养基中生长繁殖的最小微生物，是泌尿生殖道常见的条件致病菌。解脲支原体大小为125～250 μm，分子量为 4.5×108，能通过0.45 μm的微孔滤膜，没有细胞壁，因此在形态上呈高度多形性，在-70℃冻干状态下可以保存数年之久。

近年来，UU感染的发病率越来越高，临床上对宫颈分泌物检测UU阳性的患者，常常盲目使用抗生素，导致耐药现象严重，给UU感染的彻底治疗带来了很大的困难［12］。目前有许多学者从 UU的致病性、药物及治疗机理等方面进行研究，这些研究都需要建立良好的解脲支原体感染动物模型，模型的顺利建立将为以后的各种研究奠定良好的基础。国外曾有学者用解脲脲支原体接种多种哺乳动物未获成功，因此曾一度认为由人体分离出来的解脲脲支原体只能在人体内生存。直至1989年Furr与Taylor-Robinson［13］在接种前给予小鼠皮下注射0.5 mg的雌二醇，隔周1次，共4次。并于第2次注射后用吸液管取50 μL解脲脲支原体悬液注入阴道。实验结果显示雌二醇处理的小鼠，其阴道粘膜的多核白细胞减少或消失，解脲脲支原体能够定植于经激素处理的小鼠生殖道，并且能够上行播散至卵巢、肝、脾。而没有接受激素处理的小鼠，解脲支原体无法在其生殖道定植。在此基础上，国内外很多研究者［14-16］已成功建立UU感染动物模型，实验动物多以大小鼠及新西兰白兔为主。

本文在其他学者的研究基础上对解脲支原体感染的不同造模方法进行优劣比较，探索最优良的造模方法。采用阴道接种菌液的方法给 Wistar大鼠、BALB/c小鼠同时造模，并给出不同的干预措施，观察各自的造模结果。从本实验的观察结果可得出结论，BALB/c小鼠较 Wistar大鼠阴道接种解脲支原体造模成功率更高。此外，研究发现雌激素预处理及多次阴道菌液接种均能增加解脲支原体的定植率。本研究探讨的以BALB/c小鼠为对象，雌激素预处理、多次阴道菌液接种的造模方法较为优良，可供学者选择，并为今后更深入的实验研究提供理论基础。

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Optimization of animal models of Ureaplasma urealyticum infection

LIU Wen-e1，ZHANG Wan-Ni2，ZHOU Yi3，WANG Jian1
(1.Department of Gynecology and Obstetrics，First Affiliated Hospital，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，China;2.The 2008 Seven-year Graduate Class;3.The 2009 Seven-year Graduate Class of Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410007)

ObjectiveTo explore different methods for establishing animal models ofUreaplasma urealyticum(UU)infection and to select the best method of establishment of this disease.MethodsSPF female BALB/c mice and Wistar rats were multiple-infected with small dose of UU liquid or single-infected with high-dose UU liquid，pretreated withestradiol benzoate，to establish models ofUreaplasma urealyticuminfection.Cervical secretion was taken for UU culture at 14，28，42 and 56 days after the first time UU treatment，and the reproductive organs were taken for histopathological examination.ResultsGross examination of the UU-infected rats showed generally less serious lesions than the mice.The low-dose estrogen group was worst，showing hyperemia and edema，cervical hypertrophy，hydrosalpinx，enlargement，and more rigid with poor elasticity.Significant differences were observed in the vaginal UU colonization rates between the lowdose estrogen and low-dose non-estrogen groups，high-dose estrogen and non-estrogen groups，low-dose estrogen and highdose estrogen groups，low-dose estrogen and non-estrogen groups，in both the mice and rats(P＜0.05 for all).The same dose estrogen treatment caused a higher UU colonization rate in the mice than rats(P＜0.05).Histological examination showed that the low-dose estrogen treated rats had no obvious pathological changes，except loose tissue edema in some rats，but apparent pathological changes were observed in the low-dose estrogen treated mice.ConclusionsThe vulvar lesions in the mice are worse than in the rats.Estrogen pre-treatment can increase theUreaplasma urealyticumcolonization rate in the animals.The UU colonization rate in the vagina of mice is higher than in the rats，and multiple low-dose UU treatment produces a higher UU colonization rate than a single high-dose UU treatment.Therefore，BALB/c mice are more susceptible toUreaplasma urealyticuminfection，with more serious pathological changes，and are more suitable for experimental studies of related diseases.

Ureaplasma urealytium，infection;Model，animal;Rats;Mice;Optimization research

R-33

A

1671-7856(2016)12-0038-07

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.008

2016-07-01

湖南省科技厅课题，编号:2012TT2024。

刘文娥(1972-)，女，副主任医师，硕士，研究方向:妇科炎性疾病中医药防治研究，E-mail:liuwene@163.com。