反向遗传操作技术在瘟病毒属研究中的应用

洪焜，刁乃超，李建明，时坤*，杜锐,3*

(1.吉林农业大学动物科技技术学院，长春 130118；2.吉林农业大学中药材学院，长春 130118；3.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，长春 130118)



反向遗传操作技术在瘟病毒属研究中的应用

洪焜1，刁乃超1，李建明2，时坤2*，杜锐2,3*

(1.吉林农业大学动物科技技术学院，长春 130118；2.吉林农业大学中药材学院，长春 130118；3.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，长春 130118)

反向遗传操作技术已经成为研究瘟病毒属的一条有效的途径。针对反向遗传技术在瘟病毒属基因结构和功能研究、致病机制研究和新型疫苗研制中的应用以及瘟病毒属的感染性克隆策略的选择进行了综述，以期为预防、控制和消灭瘟病毒属病毒提供参考。

反向遗传操作技术；瘟病毒属；致病机制；应用

瘟病毒属(Pestivirus)属于黄病毒科(Flaviviridae)，包括典型的猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、绵羊边界病毒(Border disease virus，BDV)[1]、非典型的Hobi样病毒(Hobi-like virus)[2]、Bungowannah瘟病毒(Bungowannah virus)[3]等。由CSFV和 BVDV引起的猪瘟和牛病毒性腹泻-粘膜病给各国畜牧业造成了严重的危害和经济损失[4]。瘟病毒属病毒的全基因组为单股正链RNA，长度约为12.3 kb，两端包含5′非编码区(untranslated region，UTR)和3′非编码区(UTR)，中间是一个大的开放性阅读框架(open reading frame，ORF)；ORF翻译成含约3898个氨基酸残基、分子量约438 kD的多聚蛋白，在病毒和宿主细胞酶的作用下加工成结构蛋白C、Erns、E1、E2和非结构蛋白Npro、p7、NS2-3(NS2，NS3)、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B[5]。

反向遗传学通常是在获得生物基因信息的基础上，建立一个基因组的全长cDNA感染性克隆，对基因有目的地进行定点突变、基因的插入/缺失和基因置换等重组操作，来研究生物基因结构和功能的策略；其目的是研究病毒的复制，病毒蛋白的功能，病毒重组的发生率，病毒与宿主相互作用以及防治病毒策略和研发标记疫苗等[6]。

1 反向遗传技术在瘟病毒属研究中的应用

1.1 在瘟病毒属基因组结构和功能研究中的应用

Moormann等通过反向遗传操作技术成功构建了瘟病毒属CSFV的第一个感染性cDNA克隆，同年Meyers 等成功构建了BVDV感染性cDNA克隆，并都得到了各自的感染性病毒粒子[7-8]。Pankraz等通过对感染性BVDV cDNA克隆的3′UTR的茎环结构引入碱基的缺失，去研究基因3′UTR的功能，发现3′UTR调节基因的复制[9]。

Mischkale等在BVDV-2 890株全长cDNA感染性克隆p890的基础上通过基因缺失构建了BVDV-2 890株C蛋白基因的缺失克隆p890△C，体外转录后的p890△C RNA转染细胞，发现病毒亚基因组的自主复制和病毒蛋白表达，但未获得感染性病毒粒子；但是把p890△C RNA转染进能稳定表达BVDV-1蛋白C-Erns-E1-E2的互补细胞WT-R2，在72 h后能检测到病毒的自主复制，在转染后的上清和转染的细胞传代中存在感染性假病毒粒子v890△C-trans，但是v890△C-trans不能在没有互补的KOP-R细胞上传代[10]。Gladue等通过酵母双杂交系统对CSFV的C蛋白基因的OS9结合位点进行替换，得到的重组CSFV在猪实验没有发现毒力的改变，但是在细胞培养中能显著降低病毒复制效率[11]。

Risatti等通过反向遗传技术构建了CSFV高致病性Brescia株和减毒疫苗CS株的嵌合体，又构建了含BVDV NADL株E2的同源氨基酸序列的Brescia突变体去研究E2糖蛋白的毒力作用，发现在E2基因特定位置的氨基酸替换能导致CSFV毒力的部分或完全衰减[12-13]。Fahnøe等对CSFV Koslov 株全长cDNA克隆的氨基酸序列重组，并在猪上实现病毒拯救，发现在Koslov株E2蛋白的两个单一氨基酸(S763L和P968H)的变化，导致病毒感染猪时感染能力的衰减，在非结构蛋白NS3的单一氨基酸(D2183G)的突变能减少病毒在体外细胞内生长[14]。

Tratschin等在CSFV Alfort/187株感染性克隆的基础上用鼠泛素基因代替Npro基因，得到重组病毒vA187-Ubi，发现Npro对病毒的复制不是必须的[15]。Mischkale等构建了BVDV 890株的全长cDNA感染性克隆p890和缺失克隆p890△Npro，得到感染性病毒粒子v890FL和缺失Npro基因的病毒粒子v890△Npro，发现v890FL与亲本毒株生长特性相似；而v890△Npro与亲本毒株相比，生长速度明显偏低，表明Npro蛋白对病毒的复制不是必须的，但能影响病毒的生长[10]。陶洁构建了BVDV SH-28株的全长cDNA感染性克隆，和缺失Npro基因的亚克隆，得到感染性病毒vASH和缺失Npro基因病毒vASH△Npro，发现vASH△Npro的复制速度远低于vASH和亲本病毒；进一步研究发现Npro的过量表达可显著抑制MDBK细胞内抗病毒蛋白OAS、Mx1和ISGIS的表达，而缺失Npro蛋白后胞内抗病毒蛋白OAS、Mxl和ISG15的表达量显著增加，可能是Npro影响复制的原因[16]。

NS2蛋白对病毒RNA复制和感染性病毒产生是重要的。Ling L等构建了含有海肾荧光素酶2A(Rluc2A)报告基因的CSFV嵌合cDNA克隆pA187-Rluc，并对NS2的N端的几个代表性的保守残留序列进行了基因突变；发现在NS2的N-末端的2个天冬氨酸(NS2/D60A或NS2/D60K和NS2/D78K)的突变导致感染性病毒不能产生，并且在NS2100处的丙氨酸(NS2/R100A)被精氨酸取代后导致病毒滴度显著降低。含有突变病毒基因组RNA分子(NS2/A60D、NS2/K60D和NS2/K78D)的细胞在连续传代后，产生恢复突变，导致感染性病毒的恢复。在NS2/R100A突变体上游NS2/I90L的突变能恢复感染性病毒产生。揭示CSFV的NS2N-末端在调节病毒RNA中的新功能，NS2的氨基酸残基在RNA复制水平上发生作用[17]。Risager等在大肠杆菌内对含有CSFV全长病毒cDNA的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)通过进行靶向重组修饰，添加荧光素酶(Rluc)报道序列，体外转录RNA并通过电穿孔转染细胞。通过荧光素酶蛋白表达的积累以及检测胞内的CSFV NS3蛋白产生去检测RNA的翻译和复制。发现复制子中包含的病毒E2编码区对于复制效率是有利的。用来自高毒力的Koslov株或疫苗株Riems的等同序列取代来自Paderborn株的NS2和NS3编码区的嵌合RNA，复制被阻断[18]。

Tamura等构建了CSFV的GPE-疫苗株与高毒力Eystrup株的NS4B嵌合病毒复制子，发现携带完整Eystrup NS4B基因嵌合低毒力GPE-衍生的病毒在猪中致病性增强。嵌合GPE-NS4B复制子的体外复制效率显著高于在NS4B中仅携带两个Eystrup特异性氨基酸的复制子。发现NS4B的N-末端结构域可以确定细胞培养中的CSFV基因组复制和在猪中的病毒致病性[19]。

Sheng Chun等构建了CSFV Shimen株全基因克隆，并在病毒cDNA相应的NS5B、NS3、NS5A位置进行突变，发现NS5B上的依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)活性位点的突变能使CSFV病毒包装失败，额外添加 NS5B 不能使病毒的可育性恢复，但NS5A 却可以用反式作用因子发挥作用[20]。姬伟等通过对CSFV疫苗C株基因组NS5B分段改造后，结果发现该病毒复制、包装失败，将NS5B从基因组缺失之后额外补充NS5B 同样不能恢复病毒的可育性。可能是因为 NS5B 上有CSFV复制或组装所需的顺式作用元件，其缺失后导致缺失该基因的部分不能复制或正常组装到子代病毒[21]。Risager等用来自Koslov株的RNA聚合酶编码序列替换Paderborn 株NS5B编码序列能大大增强了复制子报道蛋白的表达。相比之下，用Riem NS5B序列替换显著降低复制子的复制效率[18]。

1.2 在瘟病毒致病机制研究中的应用 Tamura等从猪扁桃体分离出的弱化疫苗CSFV “GPE-”株在传11代后的GPE-/P-11病毒存在E2(T830A)、NS4B (V2475A和A2563V) 3个氨基酸突变位点，用反向遗传学重建了这3个氨基酸突变的病毒，通过在猪的感染性实验证实这3个氨基酸取代是致病性下降的原因，而且E2中基因的置换影响病毒扩散，并且NS4B的改变增强了病毒RNA的复制[22]。

Wu Rd等以高毒力CSFV的Shimen株 (vSM)为主干，构建的包含CSFV疫苗C株E2基因的嵌合病毒(CSFV) vSM/CE2，在猪的攻毒实验中出现毒力的致弱，但是vSM/CE2在PK15细胞中传了几代后毒力能被恢复，进一步研究发现，vSM/CE2第11代的突变体vSM/CE2-p11在E2的T745I和M979K处有2个氨基酸突变。通过感染猪的试验表明在M979K氨基酸的置换是致病性改变的主要原因。体外研究表明，E2的T745I和M979K能增加感染性病毒的复制和产生。同时发现，位于E2蛋白的745和979位置的2个氨基酸残基对嵌合病毒(CSFV)vSM/CE2体外的复制和体内的致病性改变是重要的[23]。

Velazquez-Salinas等通过基因突变构建了CSFV强毒株Brescia(BICv)株E2基因的4个不同的突变克隆(pCSFm1～pCSFm4)，但只有三个克隆产生了感染性病毒粒子(CSFm2v、CSFm3v和CSFm4v)。猪感染CSFm2v后呈现病毒血症减少和扩散，但没有显现出任何与猪瘟(CSF)相关的临床症状，原因是在感染猪后，CSFm2v复制能力与亲本BICv相比严重下降。动物感染CSFm2v后检测到动物感有病毒血症的减少和扩散，但没有显示任何猪瘟(CSF)相关的临床症状，并能耐受亲本病毒BICv的攻毒[24]。

Tamura等通过活减毒CSF疫苗株GPE-的全长cDNA感染性克隆体外拯救了多个含有Npro突变和缺失Npro的病毒，并接种猪，发现携带在Npro的N136D取代的病毒恢复了降解IRF3和体外抑制IFN-α/β诱导的能力。并且在猪中，Npro显著降低淋巴器官中的局部IFN-α mRNA表达，同时增加循环中IFN-α/β的量，并增强中等毒性病毒的致病性。缺失Npro可以减少毒性和诱导免疫无特定病原体(SPF)的猪[25]。Lamp B等将以CSFV p447株为模板的NS3突变序列插入到cp CSFV复制子克隆 p447rep中，得到NS3编码区突变的病毒，发现NS3的编码区是瘟病毒属基因组复制和编码的一个关键组件；NS3编码区突变，并不直接影响病毒基因组的复制速度[26]。Fahnøe等在研究CSFV高毒力的Koslov株时，从感染Koslov株的猪血液中提取RNA，得到非功能性的cDNAs，通过逐步定点突变，消除非同义突变,得到了与CSFV高毒力株Koslov全部功能性一致的CSFV的cDNA。通过感染猪的实验，发现通过功能cDNA重组得到的病毒在强毒力上与亲本病毒(Koslov株)一致，伴随着感染动物出现明显的临床症状并导致高的死亡率，证明了几个氨基酸的改变能有效改变病毒的功能，在自然宿主动物上降低病毒的毒力[14]。

1.3 在新型疫苗研制中的应用 反向遗传操作技术已经成为研究新型疫苗的实用的工具，如研发标记疫苗，减毒疫苗，嵌合疫苗等。Holinka LG等构建了CSFV的FlagT4v 株的双抗标记疫苗，在FlagT4v的E1处插入19mer，作为阳性标记，并在E2处引入单克隆抗体WH303(mAbWH303)表位的结合位点作为阴性标记，用于区分天然感染的和接种的猪，突变FlagT4v在接种猪后的早期(2 d或3 d)和后期(28 d)的猪能CSFV Brescia株感染，FlagT4V在猪中诱导的抗体反应对Flag®表位强烈反应，但不能抑制mAbWH303与代表WH303表位的合成肽的结合[27]。付强等通过构建具有T7 RNA聚合酶活性和较好稳定性的MDBK-T7RNAP细胞，构建了BVDV NADL毒株的E2和NS4B定点突变株BVDV E2M和NS4BM；与亲本NADL株相比，BVDV E2M和NS4BM mRNA的复制水平能力和增殖能力有所下降；并且得到的BVDV点突变株 E2M和NS4BM具有好的遗传稳定性[28]。

Li Yongfeng等以高毒性CSFV石门株的遗传背景构建了含有EGFP标签和自疫苗株HCLV(C株)3′UTR的标记嵌合病毒。标记嵌合病毒与仅有EGFP标签的重组CSFV病毒或亲本病毒相比，有低约100倍的病毒滴度，更低的病毒基因组复制水平和更弱的荧光强度。并且标记嵌合体在接种的猪后没有显示病毒血症，接种15 d后能免于致死性CSFV攻击[29]。

高飞等在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞致弱疫苗株HUN4-F112的全长感染性克隆上，插入CSFV疫苗株C株的E2基因，得到能表达猪瘟C株E2蛋白的重组PRRSV vA-C-E2。重组病毒vA-C-E2传代过程中至少在20代保持遗传稳定；且发现此突变病毒与亲本病毒vHuN4-F112在病毒滴度、空斑形态、蛋白表达等方面差异不显著；在病毒的峰滴度和病毒增殖趋势上相似[30]。董超等在CSFV疫苗C株和强毒石门株感染性克隆的基础上，对两个毒株不同蛋白区段进行相互置换，构建了一系列重组嵌合病毒，发现非结构蛋白NS2-NS4B区以及NS2跨膜区域对猪瘟病毒的增殖是重要的，在疫苗C株基因组两端的UTR以及结构蛋白区域能够介导兔体发热反应[31]。

2 感染性克隆策略的选择

目前，国内外构建感染性克隆构建方法，主要有典型的细菌质粒载体重组策略、基于细菌人工染色体(BAC)重组策略和酵母菌的重组策略。由于瘟病毒属的基因组对大肠杆菌质粒载体具有毒性，存在不稳定性，所以典型的瘟病毒属全长cDNA克隆大都需在细菌低拷贝质粒载体中构建，但是重组克隆质粒在大肠杆菌传代过程中也存在不稳定性。

2.1 基于细菌人工染色载体的克隆 BAC载体已经被用于多种病毒全基因感染性克隆的构建，如人巨细胞病毒(HCMV)等[32]。Rasmussen等通过RT-PCR扩增与参考毒株基因一致的全长CDNA复制子，插入到单拷贝的BAC载体pBeloBAC11的策略，构建了4个病毒(BVDV-CP7、BDV-Gifhorn、CSFV-C、CSFV-Paderborn)的全长cDNA克隆[33]。Risager PC等通过BAC构建CSFV的复制子去分析影响病毒RNA复制的因素[19]。Kamboj等通过over-lap PCR和重组技术在BAC载体构建了CSFV野生分离株感染性cDNA克隆，通过使用CSFV特异多克隆血清的FAT实验和RT-PCR对拯救出的vCSFV与亲本CSFV进行分析，发现两者的特性相似[34]。

2.2 基于酵母同源重组的克隆 酵母菌同源重组的方法已经应用在多种病毒的cDNA克隆的构建，如登革热病毒[35]。与其他重组DNA技术相比，酵母菌同源重组克隆是一个有效率的和节约成本的方法，酵母菌同源重组中，需DNA片段末端含有与载体末端同源的序列，两者在宿主细胞内经过同源重组能直接克隆[36]。Arenhart等通过酵母同源重组在非致细胞病变型 BVDV的Npro和C蛋白编码区插入Gluc报告基因，构建全长cDNA克隆，得到能表达Gluc报告基因且能复制的病毒，拯救病毒在细胞培养中能稳定传15代以上，与母本的病毒复制动力学，大小，形态学保持相似性；通过Gluc活性检测证明了报告蛋白能正确表达，表明基因增加了555 bp后在酵母菌重组中能被简单组装并且cDNA克隆能稳定表达[37]。Arenhart等又通过酵母同源重组技术把BVDV NADL株的两端的UTRs和巴西BVDV IBSP4ncp株的ORF的连接起来，成功得到BVDV的嵌合cDNA感染性克隆，通过病毒拯救，得到了能扩增的病毒IBSP4ncp，病毒IBSP4ncp在复制动力学、大小和形态学上与亲本病毒具有相似性。而且病毒IBSP4ncp能够在细胞培养中能够稳定传10代，并且在细胞中能维持其复制能力不被改变[38]。

3 展 望

随着反向遗传操作技术在基因组操作中的出现，推进了瘟病毒属病毒研究的发展。我们就反向遗传技术在过去和当前在瘟病毒属的研究和应用展开描述，虽然对病毒的复制和翻译的研究已经有很多，但是病毒蛋白质的机制研究仍处于起步阶段。反向遗传技术可能为瘟病属的急需解决的问题如疾病防治、致病机制、持续性感染机制、疫苗研究等提供一个实用的工具。我们认为关键的是通过该技术推进瘟病属的病毒毒力、病毒种群适应性、病毒致病机制，病毒疫苗方面的研究。通过整合反向遗传技术、动物实验，设计新颖的宿主细胞等方法的优点，对下一代疫苗的开发、应对未来瘟病毒属乃至其他黄病毒科的病毒爆发是至关重要的。

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(编辑：李文平)

Application of Reverse Genetics Technology inPestivirusResearch

HONG Kun1, DIAO Nai-chao1, LI Jian-ming2, SHI Kun2*, DU Rui2,3*

(1.CollegeofAnimalScience&Technology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.CollegeofChineseMedicineMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 3.KeyLaboratoryofAnimalProduction,ProductQualityandSecurity,MinistryofEducationofthePeople’sRepublicofChina,LaboratoryofProductionandProductApplicationofSikaDeerofJinlinProvince,Changchun130118,China)

SHIKun,E-mail:sk1981521@126.com;DURui,E-mail:104974602@qq.com

In this paper, the application of reverse genetics in the study of the structure and function, the pathogenic mechanisms, the novel vaccines ofPestivirus, and the selection of infectious cloning strategies ofPestivirushas reviewed in order to provide reference for the prevention, control and eradication ofPestivirus.

reverse genetics technology;Pestivirus; pathogenesis; application

国家自然科学基金(31372436)；吉林省科技厅产业联盟项目(2014030918YY)；吉林农业大学校内启动基金(201425) 作者简介： 洪焜，男，硕士研究生，从事经济动物疫病研究。

时坤，E-mail: sk1981521@126.com；杜锐，E-mail: 104974602@qq.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.11

2017-01-17

A

1002-1280 (2017) 07-0057-07

S852.65