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忧遁草枝叶的化学成分及体外抗肿瘤活性研究Δ

2017-01-17黄茂莘蔡杨靖刘寿柏蔡彩虹韩鹏定曾艳波海南省农垦总医院药学部海口5703中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室海口570

中国药房 2017年7期
关键词:波谱正丁醇乙酸乙酯

黄茂莘,蔡杨靖,刘寿柏,蔡彩虹,王 军,王 炜,陈 玲,韩鹏定,曾艳波#(.海南省农垦总医院药学部,海口 5703;.中国热带农业科学院热带生物技术研究所/海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室,海口 570)

忧遁草枝叶的化学成分及体外抗肿瘤活性研究Δ

黄茂莘1*,蔡杨靖1,刘寿柏2,蔡彩虹2,王 军2,王 炜1,陈 玲1,韩鹏定1,曾艳波2#(1.海南省农垦总医院药学部,海口 570311;2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所/海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室,海口 571101)

目的:研究忧遁草枝叶的化学成分,并初步考察其体外抗肿瘤活性。方法:采用多种柱色谱技术对忧遁草95%乙醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇部位进行分离、纯化,根据理化性质和波谱数据分析、鉴定化合物结构。采用MTT法测定鉴定出的化合物对人肝癌BEL-7402细胞、人胃癌SGC-7901细胞和人慢性髓原白血病K562细胞的体外抑制活性。结果:从忧遁草枝叶中分离鉴定出8个化合物,分别为羽扇豆醇(1)、对香豆酸甲酯(2)、1-O-acyl-3-O-(β-D-galactopyranosyl)-sn-glycerol(3)、(6R,10R)-6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone(4)、邻苯二甲酸二(2-乙基-己基)酯(5)、α-D-甲基半乳糖苷(6)、β-D-甲基葡萄糖苷(7)、9-hydroxymegastigma-4,7-dien-3-one-9-O-β-D-glucopyranoside(8);化合物1对人肝癌BEL-7402细胞具有弱的生长抑制作用(半数抑制浓度为42.5 μmol/L),尚未发现其他7种化合物对上述3种肿瘤细胞有抑制作用。结论:化合物2~8为首次从忧遁草枝叶中分离得到,羽扇豆醇具有弱的抗人肝癌BEL-7402细胞的活性,该研究为忧遁草的质量评价奠定了一定的基础。

忧遁草;枝叶;化学成分;鉴定;抗肿瘤;体外

忧遁草全株入药,具有调经、消肿、祛瘀、止痛、接骨之功效[2],但是忧遁草的药用价值一直未受到重视。近年来有报道称忧遁草可用于末期淋巴癌的治疗,其药用价值由此受到医药学科研工作者的关注,进而业界对其展开了一系列的研究[3]。为充分挖掘海南产忧遁草资源的药用价值,合理利用该植物资源,本研究拟对海南产忧遁草枝叶95%乙醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇萃取部位的化学成分进行研究,并初步考察其体外抗肿瘤活性,以为寻找新的生物活性成分提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

Brucker AV-500型超导核磁共振仪、Autospec-3000型质谱仪(德国布鲁克公司);ELX-800型酶标仪(美国宝特公司);IMF-2型倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.2 试剂与色谱材料

GF254高效薄层板和柱层析用硅胶(200~300、60~80目)均购自青岛海洋化工厂;羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)和反相C18柱(美国Merck公司);三菱凝胶吸附树脂(MCI GEL CHP20P,日本三菱化学公司);二甲基亚砜(DMSO,广东西陇化工股份有限公司);MTT和RMPI 1640培养基(美国Sigma公司);小牛血清(美国HyClone公司);MEM培养基和磷酸盐缓冲溶液(PBS,北京欣经科生物技术有限公司);所有试剂均为分析纯。

1.3 药材

忧遁草枝叶于2015年10月采自海南省五指山市,由中国热带农业科学院热带生物技术研究所代正福副研究员鉴定为爵床科鳄嘴花属植物忧遁草[Clinacanthus nutans(Burm.f.)Lindau]的枝叶。

1.4 细胞

人肝癌BEL-7402细胞、人胃癌SGC-7901细胞和人慢性髓原白血病K562细胞均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

称取忧遁草新鲜枝叶3.0 kg,切碎,室温下用95%乙醇冷浸提取3次,每次7 d;过滤,合并3次滤液后经真空减压浓缩得粗浸膏,将其分散于水中成悬浊液;依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取,分别得乙酸乙酯萃取物22.8 g、正丁醇萃取物10.6 g。乙酸乙酯萃取物经MCI柱,以30%~100%甲醇-水梯度洗脱,分段收集得到11个流分(Fr.1~Fr.11);然后Fr.1(631.0 mg)经Sephadex LH-20柱[氯仿-甲醇(1∶1),V/V,下同],得到Fr.1A、Fr.1B;Fr.1A(33.5 mg)经硅胶色谱柱[氯仿-甲醇(4∶1)],得到化合物6(4.7 mg);Fr.3(480.0 mg)经Sephadex LH-20柱(甲醇),得到Fr.3A~Fr.3C;Fr.3C(71.0 mg)通过硅胶色谱柱[石油醚-乙酸乙酯(15∶1)],得到化合物2(9.4 mg);Fr.10(7.9 g)经Sephadex LH-20柱(甲醇),得到Fr.10A~Fr.10D;Fr.10D(1.08 g)再经Sephadex LH-20柱[氯仿-甲醇(1∶1)],得到Fr.10D1~Fr.10D3;Fr.10D1经硅胶柱色谱[石油醚-氯仿(10∶1)],得到化合物4(8.0 mg)和Fr.10D1A~Fr.10D1D;Fr.10D1C(26.0 mg)经硅胶色谱柱,得到化合物5(6.7 mg);Fr.10D1B(1.2 g)经硅胶色谱柱分离纯化得到化合物1(3.2 mg)和化合物3(1.7 mg)。正丁醇萃取物(10.6 g)经上述色谱技术分离得到化合物7(7.2 mg)和化合物8(2.1 mg)。

2.2 结构鉴定

化合物1:白色粉末,熔点(mp)为215~216℃,分子式为C30H50O;ESI-MS m/z:449[M+Na]+;1H-NMR(CDCl3,500 MHz)δ:4.68(1H,s,H-29),4.56(1H,s,H-29),3.18(1H,dd,J=11.4,4.9 Hz,H-3),2.37(1H,td,J=11.1,5.8 Hz,H-19),1.91(1H,m,H-21),1.68(3H,s,H-30),1.03(3H,s,H-26),0.96(3H,s,H-23),0.94(3H,s,H-27),0.82(3H,s,H-25),0.78(3H,s,H-28),0.76(3H,s,H-24);13C-NMR(CDCl3,125 MHz)δ:38.8(C-1),27.6(C-2),79.1(C-3),39.0(C-4),55.4(C-5),18.5(C-6),34.4(C-7),41.0(C-8),50.6(C-9),37.3(C-10),21.1(C-11),25.3(C-12),38.2(C-13),43.0(C-14),27.6(C-15),35.7(C-16),43.1(C-17),48.4(C-18),48.1(C-19),151.1(C-20),30.0(C-21),40.1(C-22),28.1(C-23),15.5(C-24),16.3(C-25),16.1(C-26),14.7(C-27),18.2(C-28),109.5(C-29),19.5(C-30)。以上波谱数据与文献[4]报道基本一致,故可鉴定化合物1为羽扇豆醇。

化合物2:白色粉末,mp为216~220℃,分子式为C10H10O3;ESI-MS m/z:201[M+Na]+;1H-NMR(CDCl3,500 MHz)δ:7.60(2H,d,J=8.6 Hz,H-2,6),6.88(1H,d,J=12.7 Hz,H-7),6.80(2H,d,J=8.6 Hz,H-3,5),5.83(1H,d,J=12.7 Hz,H-8),3.74(3H,s,OCH3);13C-NMR(CDCl3,125 MHz)δ:127.2(C-1),115.3(C-2),130.2(C-3),157.2(C-4),130.2(C-5),115.3(C-6),167.6(C-7),116.4(C-8),144.4(C-9),51.6(-OCH3)。以上波谱数据与文献[5]报道基本一致,故可鉴定化合物2为对香豆酸甲酯。

化合物3:白色粉末,分子式为C25H48O9;ESI-MS m/z:515[M+Na]+;1H-MNR(CD3OD,500 MHz)δ:4.17(1H,d,J=7.5 Hz,H-3),4.08(2H,dd,J=11.5,6.5 Hz,H-1),3.94(1H,m,H-2),3.70(2H,dd,J=11.0,5.0 Hz,H-3),1.25(24H,brs,H-4′~H-15′),1.57(2H,m,H-3′),2.30(2H,t,J=7.5 Hz,H-2′),0.85(3H,t,J=7.0 Hz,H-16′);13C-NMR(CD3OD,125 MHz)δ:66.6(C-1),70.3(C-2),71.9(C-3),175.5(C-1′),34.9(C-2′),26.0(C-3′),30.0~30.8(C-4′~C-13′),33.0(C-14′),23.7(C-15′),14.4(C-16′),105.3(C-1″),72.6(C-2″),74.8(C-3″),69.6(C-4″),76.7(C-5″),62.5(C-6″)。以上波谱数据与文献[6]报道基本一致,故可鉴定化合物3为1-O-acyl-3-O-(β-D-galactopyranosyl)-sn-glycerol。

化合物4:无色油状物,分子式为C18H36O;ESI-MS m/z:291[M+Na]+;1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ:2.40(2H,m),2.13(3H,s,H-1),0.86(6H,d,J=6.5 Hz,H-15,18),0.85(3H,d,J=6.6 Hz),0.83(3H,d,J=6.8 Hz),1.60~1.00(19H,m);13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:30.0(C-1),209.7(C-2),44.3(C-3),21.6(C-4),36.6(C-5),32.8(C-6),37.4(C-7),24.6(C-8),37.4(C-9),32.9(C-10),37.5(C-11),24.9(C-12),39.5(C-13),28.1(C-14),22.8(C-15),19.7(C-16),19.9(C-17),22.7(C-18)。以上波谱数据与文献[7]报道基本一致,故可鉴定化合物4为(6R,10R)-6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone。

化合物5:无色油状物,分子式为C24H38O4;ESI-MS m/z:413[M+Na]+;1H-NMR(CDCl3,500 MHz)δ:7.71(2H,dd,J=3.5,5.6 Hz,H-3,6),7.53(2H,dd,J=3.5,5.6 Hz,H-4,5),4.22(2H,t,J=6.0 Hz,H-1′),1.68(2H,m,H-2′),1.42(2H,m,H-1″),1.36(2H,m,H-3′),1.32(2H,m,H-4′),1.30(2H,m,H-5′),0.92(3H,t,J=7.4 Hz,H-2″),0.89(3H,t,J=7.3 Hz,H-6′);13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:167.9(C-1,8),132.6(C-2,7),128.9(C-3,6),131.0(C-4,5),68.3(C-1′),38.9(C-2′),30.5(C-3′),29.1(C-4′),23.1(C-5′),14.2(C-6′),23.9(C-1″),11.1(C-2″)。以上波谱数据与文献[8]报道基本一致,故可鉴定化合物5为邻苯二甲酸二(2-乙基-己基)酯。

化合物6:白色固体,分子式为C7H14O6;ESI-MS m/ z:217[M+Na]+;1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δ:4.69(1H,d,J=3.7 Hz,H-1),3.86(1H,d,J=2.5 Hz,H-2a),3.69(1H,m,H-2b),3.64~3.72(4H,m),3.31(3H,s,-OCH3);13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:101.5(C-1),72.3(C-2),71.5(C-3),71.0(C-4),70.2(C-5),62.8(C-6),55.6(-OCH3)。以上波谱数据与文献[9]报道基本一致,故可鉴定化合物6为α-D-甲基半乳糖苷。

化合物7:白色固体,分子式为C7H14O6;ESI-MS m/ z:217[M+Na]+;1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δ:4.15(1H,d,J=7.8 Hz,H-1),3.85(1H,dd,J=11.9,1.4 Hz,H-6a),3.66(1H,dd,J=11.9,5.3 Hz,H-6b),3.51(3H,s,-OCH3),3.33(1H,t,J=9.0 Hz,H-3),3.30(1H,m,H-4),3.30(1H,m,H-5),3.14(1H,dd,J=7.9,9.0 Hz,H-2);13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:105.4(C-1),75.0(C-2),78.0(C-3),71.6(C-4),77.9(C-5),62.7(C-6),57.3(-OCH3)。以上波谱数据与文献[10]报道基本一致,故可鉴定化合物7为β-D-甲基葡萄糖苷。

化合物8:白色胶状物,分子式为C19H30O7;ESI-MS m/z:393[M+Na]+;1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.91(1H,s,H-4),5.77(1H,dd,J=15.4,9.3 Hz,H-7),5.61(1H,dd,J=15.4,7.5 Hz,H-8),4.50(1H,m,H-9),4.31(1H,d,J=7.8 Hz,H-1′),3.87(1H,dd,J=11.9,2.2 Hz,H-6′α),3.65(1H,dd,J=11.9,6.2 Hz,H-6′β),3.30~3.15(4H,m,H-2′~5′),2.72(1H,d,J=9.2 Hz,H-6),2.50(1H,d,J=16.9 Hz,H-2),2.08(1H,d,J=16.9 Hz,H-2),2.00(3H,s,H-13),1.31(3H,d,J=6.4 Hz,H-10),1.05(3H,s,H-11),1.01(3H,s,H-12);13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:202.1(C-3),165.8(C-5),137.0(C-8),131.2(C-7),126.2(C-4),101.2(C-1′),78.4(C-3′),78.2(C-5′),75.0(C-2′),74.8(C-9),71.7(C-4′),62.8(C-6′),56.9(C-6),37.2(C-1),28.0(C-12),27.4(C-11),23.9(C-13),22.2(C-10)。以上数据与文献[11]报道基本一致,故可鉴定化合物8为9-hydroxy-megastigma-4,7-dien-3-one-9-O-β-D-glucopyranoside。

2.3 抗肿瘤活性考察

采用MTT法[12]进行测定。将肿瘤细胞分别培养于含有10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基中,于含5%CO2、湿度>90%、37℃恒温箱中培养,贴壁细胞用0.25%的胰酶消化。同时,设置阴性对照组(溶剂DMSO)、阳性对照组(紫杉醇)和6个质量浓度的待测样品组(0.003 125、0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1µg/mL,化合物1~8),各3份。选取对数生长期的细胞,用RPMI 1640完全培养基制成单细胞悬浮液,用血球计数板计数,调整细胞密度为50 000个/mL,接种90 μL于96孔平底细胞培养板中,置于含5%CO2、湿度>90%、37℃恒温箱中培养。在K562细胞中直接加入待测样品10 μL,BEL-7402和SGC-7901细胞培养24 h后加入待测样品10 μL,继续培养72 h后取出,置于倒置显微镜下观察每孔细胞的生长形态。然后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液(溶于PBS)15 μL,37℃反应4 h后,吸去上清液,再向各孔加入100 μL DMSO,充分溶解。将96孔平底细胞培养板置于酶标仪上,于490 nm波长处测量各孔的光密度,计算生长抑制率[生长抑制率(%)=(1-给药组光密度平均值/阴性对照组光密度平均值)× 100%]。以待测样品质量浓度(x,µg/mL)为横坐标、细胞生长抑制率(y,%)为纵坐标,利用Origin 8.0软件拟合抑制率曲线图,抑制率为50%时的样品浓度,即为细胞毒活性的半数抑制浓度(IC50)值。活性测试结果表明,化合物1对人肝癌BEL-7402细胞有弱的生长抑制活性,其IC50值为42.5µmol/L(阳性对照组为5.72µmol/L),其余7种化合物对3种细胞均未见抑制作用。

3 讨论

目前,忧遁草中已报道的化合物结构类型丰富,包括三萜类[13]、甾醇类[13]、黄酮碳苷[14]、含硫糖苷类[15]等,这些化学成分大部分已被现代药理实验研究证实具有抗肿瘤作用[16-17]。本研究利用多种柱色谱技术,从海南产忧遁草乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分离得到6个化合物、正丁醇萃取部位分离得到2个化合物,其中化合物2~8为首次从该植物中分离得到。体外抗肿瘤活性试验结果表明,化合物1对人肝癌BEL-7402细胞有弱的生长抑制活性,其他化合物对除上述3种之外的肿瘤细胞有无抑制作用有待进一步研究证实。本研究丰富了忧遁草化学成分的多样性,为忧遁草的质量评价奠定了一定基础。

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Study on the Chemical Constituents of Clinacanthus nutans Branches and Leaves and Its Anti-tumor Activity in vitro

HUANG Maoxin1,CAI Yangjing1,LIU Shoubai2,CAI Caihong2,WANG Jun2,WANG Wei1,CHEN Ling1,HAN Pengding1,ZENG Yanbo2(1.Dept.of Pharmacy,Hainan Nongken General Hospital,Haikou 570311,China;2.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Key Laboratory for Research and Development of Natural Products from Li Folk Medicine,Haikou 571101,China)

OBJECTIVE:To study the chemical constituents of Clinacanthus nutans branches and leaves and its anti-tumor activity in vitro.METHODS:Varied chromatographic techniques were conducted to separate and purify the ethyl acetate and butanol parts of 95%ethanol extracts of C.nutans,the chemical structures were analyzed and identified according to physicochemical property and spectral data.MTT method was used to determine the inhibitory activity of identified compounds on human liver cancer BEL-7402 cell lines,gastric cancer SGC-7901 cell lines and chronic myelogenous leukemia K562 cell lines in vitro.RESULTS:Eight compounds isolated from C.nutans branches and leaves were identified as lupeol(1),methyl p-coumarate(2),1-O-acyl-3-O-(β-D-galactopyranosyl)-sn-glycerol(3),(6R,10R)-6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone(4),1,2-benzenedicarboxylic acid bis(2-ethylhexyl)ester(5),methyl α-D-galactopyranoside(6),methyl β-D-glucopyranoside(7),9-hydroxy-megastigma-4,7-dien-3-one-9-O-β-D-glucopyranoside(8).Compound 1 had weak growth inhibition effect on human liver cancer BEL-7402 cell(half inhibitory concentration was 42.5 μmol/L),the other 7 compounds had not been found to inhibit the above 3 tumor cell lines.CONCLUSIONS:Compounds 2-8 are all isolated from C.nutans branches and leaves for the first time,while lupeol has weak growth inhibition effect on human liver cancer BEL-7402 cell.The study has laid the foundation for the quality evaluation of C.nutans.

Clinacanthus nutans;Braches and leaves;Chemical constituents;Identification;Anti-tumor;in vitro忧遁草[Clinacanthus nutans(Burm.f.)Lindau]是爵床科鳄嘴花属植物,别名鳄嘴花、扭序花、竹节黄、小接骨、沙巴蛇草、柔刺草等,广泛分布于华南热带至中南半岛、马来半岛、爪哇和加里曼丹[1]。在祖国传统医学中,

R917

A

1001-0408(2017)07-0895-04

2016-11-16

2017-01-10)

(编辑:刘明伟)

海南省卫生和计划生育委员会2014年度普通医学科研项目(No.14A210221)

*副主任药师。研究方向:医院药学。电话:0898-66808275。E-mail:wnhuangmx@163.com

#通信作者:副研究员,博士。研究方向:天然产物化学。电话:0898-66968571。E-mail:zengyanbo@itbb.org.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.09

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