ATM－/－小鼠Sertoli细胞对于双链DNA损伤修复的初步研究

李家轩，吴登龙，乐 威，章劲夫.同济大学附属同济医院泌尿外科，上海 00065; .上海交通大学医学院附属同仁医院，上海 0005

ATM－/－小鼠Sertoli细胞对于双链DNA损伤修复的初步研究

李家轩1，吴登龙1，乐 威1，章劲夫2
1.同济大学附属同济医院泌尿外科，上海 200065; 2.上海交通大学医学院附属同仁医院，上海 200051

目的研究ATM基因移除小鼠Sertoli细胞对于DNA双链断裂（DSB）损伤的修复作用。方法将30只4～5周龄C57小鼠随机分为ATM敲除小鼠（n=15）和对照组（n=15），各组又分为无照射和0.1 Gy电离辐射45 min、2 h、48 h组，观察处死后睾丸组织DAPI、γ-H2Ax免疫荧光染色情况。结果ATM－/－小鼠Sertoli细胞相对于ATM+/+小鼠生殖细胞对DSB损伤修复效率降低。结论ATM－/－小鼠Sertoli细胞对于DSB损伤修复效率下降。

Sertoli细胞；ATM；DNA双链断裂；DNA损伤

DNA损伤广泛存在于细胞的各项生理活动中。根据损伤DNA链壮结构的不同，可分为DNA单链断裂与DNA双链断裂（DSB）。其中，DNA双链断裂是一种更为严重的细胞DNA损伤[1]。细胞损伤主要通过非同源性末端接合（NHEJ）、同源性重组（HR）两种途径修复。共济失调毛细血管扩张突变基因（ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM）主要作用于HR途径[2]，是HR修复途径上游的重要基因。Sertoli细胞位于睾丸精曲小管，属于生精系统内部的支持细胞，以旁分泌的形式分泌多种因子，直接调控精原干细胞的自我更新、精母细胞的减数分裂，在生精过程中发挥重要调控作用[3]。目前发现，在DSB发生时，Sertoli细胞中可以检测到ATM，但敲除ATM之后，Sertoli细胞仍可进行DSB修复[4]。ATM对于Sertoli细胞修复DSB损伤是否有影响目前尚不明确。本实验利用电离辐射造成DSB损伤，通过细胞染色观察ATM敲除C57小鼠的DSB及修复情况，旨在研究ATM蛋白在Sertoli细胞DSB损伤修复的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

动物：4～5周龄C57、ATM－/－雄性小鼠各15只（同济大学干细胞研究中心提供）。荧光染色抗体：DAPI购自Santa cruz公司，γ-H2Ax购自Abcam公司。NIKON共聚焦显微型，同济大学干细胞研究中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 处理小鼠

将ATM（A组）与C57（C组）小鼠分别随机分为5组（A0、A1、A2、A3、A4；C0、C1、C2、C3、C4），予0.1Gy照射后，将A1与C1、A2与C2、A3与C3、A4与C4按注射后45 min、2 h、24 h、48 h时间节点脱颈处死，取睾丸组织。

1.2.2 免疫荧光染色

睾丸组织脱水处理后，被固定于4%多聚甲醇中，包埋冰冻，以20µm厚度切割。冰冻切片予2%牛血清蛋白处理后，分别滴加或γ-H2Ax（1：500）一抗。后予DAPI染色。

1.2.3 数据统计分析

每只小鼠随机选取1000细胞，统计DAPI（+）γ-H2Ax（+）点，并行双总体t检验（α=0.05）。数据处理软件为IBM SPSS 19.0，图像由GraphPad Prism 5绘制。

2 结果

如图1、2，对照组、ATM－/－组均表现为r-H2Ax（+）；C57小鼠生殖细胞随时间进行DSB修复。无低剂量X-ray照射时，ATM－/－小鼠Sertoli细胞DSB程度高于C57组（图3）；照射后，ATM－/－小鼠和C57组Sertoli细胞γ-H2Ax Foci点均随时间下降，但ATM－/－小鼠Sertoli细胞γ-H2Ax Foci点则较高（图4，P＜0.05）。表明，ATM－/－小鼠组Sertoli细胞DSB修复效率低于正常C57组。

图1 低剂量（0.1Gy）照射后A组小鼠睾丸γ-H2Ax表达（×400）Fig.1 Expression of γ-H2Ax in testis tissues in group A after low dose（0.1Gy）irradiation（×400）

3 讨论

DNA损伤是细胞生理过程中的常见损伤，可由射线、化学试剂、细菌分泌物等多种因素引起。而DNA双链断裂（DSB）是DNA损伤中最为严重的情况[5]。机体对于DSB主要有两种应答修复途径：1）HR修复途径：主要作用于细胞G2期，利用细胞内染色体两两对应的特性，用对应染色体DNA序列做模板来回复断裂序列；2）NHEJ途径：主要作用于细胞G1/S期，利用修复蛋白拉近断裂末端，以DNA粘合酶来粘合断裂带。不同的细胞经由不同的途径进行修复，并产生不同的结局入修复、变异、周期停滞、凋亡等[6]。

图2 低剂量X-ray照射后，C组小鼠睾丸γ-H2Ax表达（×400）Fig.2 Expression of γ-H2Ax in testis tissues in group C after low dose X-ray irradiation（×400）

图3 无照射时ATM－/－小鼠Sertoli细胞内γ-H2Ax点情况Fig.3 γ-H2Ax foci in ATM－/－mice Sertoli cells without irradiation

图4 照射后两组小鼠γ-H2Ax Foci点Fig.4 γ-H2Ax foci in both groups after irradiation

γ-H2Ax是一种在DSB损伤应答早期即出现的信号蛋白。当DSB出现时，组蛋白H2出现于DNA断端并被磷酸化成γ-H2Ax，并以此来召集ATM蛋白，激活响应的修复通路。因此，γ-H2Ax被广泛用评估DSB损伤程度[7]。

Sertoli细胞位于睾丸精曲小管中，主要分泌GDNF、FGF2等因子，支持并调控精原干细胞。在维持生精微环境中起重要作用[8]。在DSB出现后，Sertoli细胞如何进行应答修复，目前机制尚不明确[9]。

ATM基因广泛表达于全身各种细胞中，其编码的ATM蛋白作用于HR修复途径。以往研究发现，敲除ATM后，小鼠睾丸内即出现生精障碍和“唯支持细胞综合征”（Sertoli cell-only syndrome）：曲精小管中精原干细胞消失，仅存在sertoli细胞[10]。本实验使用ATM－/－小鼠，通过统计ATM－/－小鼠出现DSB后γ-H2Ax表达情况，验证ATM在Sertoli细胞DSB应答中的作用。

在照射（0.1 Gy电离辐射）后急性期内（45 min），ATM－/－Sertoli细胞与C57小鼠生殖细胞均表达r-H2Ax。ATM－/－小鼠中γ-H2Ax的foci点数量和密度多于C57小鼠，提示ATM－/－基础DSB严重，且受IR后修复效能降低。表明ATM是Sertoli细胞重要的DSB修复蛋白。随时间延长，ATM－/－或C57小鼠睾丸γ-H2Ax的foci点均逐渐减少，但ATM－/－小鼠γ-H2Ax的foci点消除慢于C57小鼠生殖细胞。说明即使敲除ATM，Sertoli细胞仍能进行DSB修复，但修复已受到影响，即敲除ATM后Sertoli细胞DSB修复效率降低。这表明，Sertoli细胞DSB损伤修复主要依靠HR途径；而最后的缓慢修复现象亦提示，NHEJ途径可能参与Sertoli细胞DSB损伤修复，但不是主要途径。ATM－/－小鼠Sertoli细胞出现DSB后，应答修复功能受损，DSB累积，功能受影响，干扰了生精微环境，甚至影响生精过程。这可能是生殖细胞缺失、减少的主要原因之一。

本实验表明，ATM基因参与了Sertoli细胞的DSB应答；ATM缺失会造成Sertoli细胞DSB修复功能下降。而Sertoli细胞仍有其他DSB修复途径。但Sertoli细胞DSB修复的具体通路如何，DSB损伤对Sertoli细胞分泌物（GDNF、FGF2）是否有影响，还需进行深入的研究。

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Repair of DNA double-strand break in ATM－/－mice Sertoli cells

LI Jiaxuan1，WU Denglong1，LE Wei1，ZHANG Jinfu2
1.Department of Urology，Tongji Hospital，Tongji University School of Medicine，Shanghai 200065，China；2.Tongren Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200051，China

ObjectiveTo study the repair of DNA double-strand break（DSB）in ATM－/－ mice sertoli cells.MethodsThirty C57 mice aged 4 to 5 weeks were randomly divided into ATM－/－mice group（n=15）and control group（n=15），and each group was randomly subdivided into 0.1 Gy ionizing irradiation 0 min，45 min，2 hr and 48 hr groups. The immunofluorescence staining of DAPI and γ-H2Ax in testis tissues after sacrifice was examined.ResultsATM－/－mice sertoli cells had a lower efficiency in repair of DSB than ATM+/+mice germ cells.ConclusionThe efficiency of DSB repair in ATM－/－mice sertoli cells is decreased.

Sertoli cell；ATM；DNA double-strand break；DNA damage

R698+.2

A

2095-378X（2016）01-0012-04

10.3969/j.issn.2095-378X.2016.01.004

2015-12-30）

李家轩（1989—），男，硕士研究生，研究男科方向

吴登龙，电子邮箱：Wudenglong@163.com