铁蛋白轻链在前列腺癌中的表达及意义

陈宁 陈晨 李治国 曹凤宏△

(1华北理工大学附属医院泌尿外科；2华北理工大学医学中心实验室,河北 唐山 063000 )

铁蛋白轻链在前列腺癌中的表达及意义

陈宁1陈晨1李治国2曹凤宏1△

(1华北理工大学附属医院泌尿外科；2华北理工大学医学中心实验室,河北 唐山 063000 )

目的 研究FLC在前列腺癌与前列腺增生中的表达及临床意义。方法 采用免疫组织化学方法，对前列腺癌和前列腺增生患者病理切片进行组化检测；采用蛋白质印迹法对收集的前列腺癌和前列腺增生患者术后标本进行蛋白定量。结果 FLC蛋白在前列腺癌和前列腺增生中过表达率分别是63.3%和20%，差异有统计学意义(P<0.05)；FLC蛋白在年龄、术前PSA、前列腺体积、Gleason评分、临床分期、淋巴结转移各分组中差异无统计学意义(P>0.05)；在远处转移各分组中FLC蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。前列腺癌组与前列腺增生组FLC蛋白表达水平分别为(1.52±0.27)和(0.41±0.21)，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 FLC蛋白在前列腺癌中高表达，可以作为前列腺癌新的诊断手段；FLC蛋白在前列腺癌的发展过程中起重要作用。

铁蛋白轻链； 前列腺癌； 免疫组化； 蛋白质印迹法

前列腺癌与前列腺增生之间存在着大量差异蛋白，课题组挖掘出研究较少或未曾研究的差异蛋白，铁蛋白轻链蛋白(ferritin light chain, FLC)就是其中之一。我们收集前列腺癌与前列腺增生患者病理切片及术后标本，采用免疫组织化学及蛋白质印迹法(Westen blot)检测前列腺癌组和前列腺增生组中FLC蛋白表达情况。

1 资料和方法

1.1 一般资料 从华北理工大学附属医院收集2007年1月至2014年10月前列腺癌患者及2013年1月至2014年10月前列腺增生患者临床资料，根据随机数字表法抽取前列腺癌患者和前列腺增生各30例，最后从华北理工大学附属医院病理科获得30例前列腺癌和30例前列腺增生患者病理切片。前列腺癌患者年龄51～88岁，平均(73.10±8.47)岁，血清PSA水平0.89～102.10ng/mL，平均(50.99±37.02)ng/mL；前列腺体积26.20～142.30cm3，平均(58.22±29.13)cm3。患者术前均未经抗雄激素及放疗处理，行手术治疗，术后病理报告均为：前列腺腺癌。临床分期和病理分期采用2002年AJCC的TNM分期系统。前列腺增生患者年龄55～90岁，平均(72.10±8.98)岁；血清PSA水平0.36～29.86ng/mL，平均(5.38±7.17)ng/mL；前列腺体积23.16～154.77cm3，平均(67.68±29.28)cm3。行经尿道前列腺电切术治疗，术后病理报告均为：良性前列腺增生。主要试剂为FLC山羊多克隆抗体购自英国Abcam公司，Polink-2 plus®免疫组化检测试剂购自美国GBI公司，内参基因β-actin购自美国AmeriBiopharma公司；二甲苯、梯度酒精、柠檬酸修复液，1×电泳缓冲液、半干转液、TBST等实验试剂由华北理工大学医学中心实验室提供。

1.2 方法 (1)免疫组化实验步骤：恒温烤箱中烤片，二甲苯及梯度酒精脱蜡、脱水，3%过氧化氢抑制内源性过氧化物酶活性，柠檬酸修复液高压修复抗原，滴加一抗FLC(1∶250)4 ℃过夜；第2天，PBS冲洗3次，滴加聚合物辅助剂(试剂1)，37 ℃恒温箱中孵育25 min，PBS冲洗3次，滴加PV-9003(试剂2)，37 ℃恒温箱中孵育25 min，PBS冲洗3次,显微镜下DAB显色，苏木素复染，分化液、清水中返蓝，经梯度酒精和二甲苯脱水、透明及树脂封片完成免疫组化染色操作。免疫组化评分为染色程度：根据阳性细胞的百分比分级从0～3，0分为无；1分为1～30%；2分为31%～60%；3分为>60%。染色强度：分级从0～3，0分为无色、1分淡黄色、2分棕黄色、3分棕褐色。用两者评分相乘得最终评分，0～3分认为是低表达(-)，>3分认为是过表达(+)。用PBS代替一抗作为阴性对照。由病理科医生在双盲条件下完成。(2)提取组织蛋白及Western blot检测FLC蛋白表达量：往研体中加入液氮，放入组织标本，充分研磨组织，加入RIPA裂解液，混均，10 000转、4 ℃条件下，离心30 min，取上清液，得到组织蛋白。Western blot试验步骤：用生物光谱仪测定蛋白浓度，蛋白上样量为15 μg，用12%SDS-PAGE凝胶跑胶，经电泳、转膜及封闭，加入山羊抗人一抗FLC(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入兔抗山羊二抗(1∶1 000)，室温孵育2 h，TBST洗膜，ECL显色，条带扫描拍照后用Quantity One软件进行灰度值分析。重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计处理，前列腺癌组和前列腺增生组表达率比较用卡方检验，根据年龄、前列腺体积、术前PSA水平、Gleason评分、临床分期等水平不同，将前列腺癌组分层，采用Fisher确切概率法，计量资料使用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FLC在前列腺癌与前列腺增生组织中的表达情况 FLC蛋白染色主要位于细胞浆和细胞膜。在前列腺癌中，FLC的过表达率为63.3%(19/30)；在前列腺增生中，FLC的过表达率为20%(6/30)，两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、图2。

图1 FLC蛋白在前列腺癌组织中的表达情况(×200)

图2 FLC蛋白在前列腺增生组织中的表达情况(×200)

2.2 FLC蛋白与前列腺癌主要临床指标的关系 在前列腺癌患者年龄分组、前列腺体积分组、术前PSA分组、Gleason评分分组、临床分期分组、淋巴结转移分组中差异无统计学意义(P>0.05)；在远处转移分组中差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 FLC蛋白表达情况与临床病理参数的关系

2.3 Western blot检测FLC蛋白表达情况 Western blot检测前列腺癌组和前列腺增生组FLC蛋白表达情况,可见前列腺癌组(1.52±0.27)和前列腺增生组(0.41±0.21)相比，两组之间差异具有统计学意义(P=0.001)。见图3。

图3 前列腺癌(PCa)组和前列腺增生(BPH)组蛋白表达情况

3 讨 论

笔者课题组通过前期准备工作发现在前列腺癌与前列腺增生之间存在一些差异蛋白，筛选出其中研究较少或未曾研究的差异蛋白。由于蛋白组学和基因组学其本身的缺点及限制性，需要采用实验手段进行深入研究及验证。

目前发现铁蛋白水平的升高与恶性肿瘤等疾病密切相关，并且人们已经进行了相关实验研究[1]。在常染色体显性遗传病遗传性高铁蛋白血症—白内障综合征中发现铁蛋白含量增加并对铁蛋白的作用机制进行了探讨[2]。在关于黑色素瘤研究的文献中报道了铁蛋白的表达水平在黑色素瘤中是明显升高的，铁蛋白水平的高低与黑色素瘤的恶性程度密切相关，并在黑色素瘤的发展过程中起重要作用[3]。经过近年来的研究发现，铁蛋白重链与多种肿瘤的发生发展密切相关，作为与重链结构类似的铁蛋白轻链是否也参与肿瘤的发生发展过程，引起了人们的兴趣，并进行了一些相关实验研究与文献报道。有关研究发现在高级别骨肉瘤中，肿瘤的恶性程度越高，FLC蛋白的表达量越高，则预后较差[4]。已知在人类黑色素瘤中FLC蛋白水平是升高的，发现如果使FLC蛋白表达含量降低，则黑色素肿瘤患者的病情得到缓解，生存期延长[5]。同时有关文献报道了FLC蛋白的含量在甲状腺癌中是升高的，且FLC蛋白在卵巢癌中的表达也是升高的，可作为诊断卵巢癌的生物标志物[6-7]。目前对于FLC蛋白在乳腺癌发生发展中作用的研究较多，经研究发现，与对照组相比，乳腺癌组患者的FLC蛋白表达量升高[8]。随着乳腺癌恶性程度的逐渐增加，铁蛋白重链和铁蛋白轻链的含量也逐渐增加，铁蛋白含量的改变可以影响乳腺癌的发展过程[9]。总之，FLC蛋白水平在乳腺癌中明显升高，并进一步研究了FLC蛋白在乳腺癌中的细胞定位及在乳腺癌发生发展的作用，推论出FLC蛋白对乳腺癌预后判断有一定指导价值[10]。并且已有研究发现可以通过FLC蛋白对乳腺癌进行诊断及预后进行判定，为乳腺癌的治疗提供了一个新的分子靶向，对于提高乳腺癌患者的生存期及对有效缓解病情的发展有重要意义[11]。笔者课题组为了探讨FLC蛋白与前列腺癌之间的关系，采用免疫组织化学及Western blot实验方法，发现FLC蛋白在前列腺癌组中表达量升高。这些初步研究结果为以后将要进行的细胞水平实验奠定了基础。

综上所述，FLC蛋白在前列腺癌中表达量增加，对前列腺癌的发展起重要作用。检测FLC蛋白对鉴别前列腺癌与前列腺增生有一定的帮助，并且能够对前列腺癌的恶性程度进行初步判断，可以作为已有前列腺癌诊断手段的有益补充。

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Expression and significance of Ferritin Light Chain in prostate cancer

ChenNing1,ChenChen1,LiZhiguo2,CaoFenghong1.

1DepartmentofUrology,theAffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,Hebei,China. 2.CentralLaboratoryofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,Hebei,China.

Objective To study the expression and clinical significance of FTL in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia. Methods Immunohistochemical method was used to detect the pathological changes of the patients with prostate cancer and benign prostatic hyperplasia; protein quantification was performed on specimens collected from patients with prostate cancer and benign prostatic hyperplasia by Western blot. Results The expression rates of FTL protein in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia were 63.3% and 20%, respectively, and there were statistical significantly differences(P<0.05). But there were no statistical significantly differences of the FTL protein in the different groups of age, PSA, prostate volume, Gleason score, clinical stage and lymph node metastasis(P>0.05). There were statistical significantly differences of the expression level of FTL protein in the groups of distant metastases(P<0.05). The expression level of FTL protein in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia were (1.52±0.27) and (0.41±0.21), respectively, and there were statistical significantly differences(P<0.05).Conclusion FTL protein is highly expressed in prostate cancer, which can be used as a new diagnostic tool for prostate cancer. FTL protein plays an important role in the development of prostate cancer.

Ferritin Light Chain； Prostate cancer； Hyperplasia of prostate Immunohistochemistry； Western blot

R691.9

A

1000-744X(2016)06-0569-03

2016-03-25)

△通信作者，E-mail：cfh@163.com