木质素对粗纤维瘤胃降解率的影响及提高木质素瘤胃降解率方法的研究进展

许浩，李翔

（华中农业大学动物科技学院，武汉 430070）

木质素对粗纤维瘤胃降解率的影响及提高木质素瘤胃降解率方法的研究进展

许浩，李翔

（华中农业大学动物科技学院，武汉 430070）

饲草中的粗纤维含量与反刍动物对粗饲料干物质的消化率呈负相关，而粗纤维中的木质素又影响瘤胃微生物对纤维素及半纤维素的消化，因此木质素在一定程度上影响着反刍动物对粗饲料的消化利用率。本文综述了木质素影响粗纤维降解的各种原因及克服办法，为科研工作者提供参考。

反刍动物；瘤胃微生物；粗纤维；木质素；消化率

天然木质素是一种无色或者白色粉末，核心（core lignin）由苯丙烷的衍生物聚合而成，包含愈创木基（G）、紫丁香基（S）、对羟基苯基（H）三种单体，草类植物中还含有二阿魏酸、香豆酸等非核心木质素（noncore lignin）。木质素与酸性呋喃类溶液作用呈绿色，与酸性吡咯类溶液和吲哚类溶液作用呈红色。木质素与纤维素、半纤维素通过化学键连接，纤维素与半纤维素通过氢键连接。草类植物中，木质素还通过二阿魏酸等非核心木质素与半纤维素相连，木质素内部单体间以复杂的化学键连接，聚合成稳定的结构。正是这种纷繁芜杂的连接方式使得植物细胞壁稳定而不易消化。反刍动物瘤胃微生物可以分泌消化纤维素和半纤维素的酶，如果没有木质素，理论上纤维素和半纤维素可以完全被消化利用[1]。因此，了解木质素是如何影响纤维素、半纤维素乃至粗饲料干物质的降解，通过科学手段克服这种阻碍，对世界的饲料业及养殖业发展将产生巨大促进作用。

1 木质素对饲草粗纤维瘤胃降解率的影响

1.1 木质素浓度对饲草粗纤维消化利用率的影响

木质素在传统营养学上被认为是不能被降解的物质，但近来越来越多的研究报道认为，木质素可以被瘤胃微生物降解[2,3]。虽然瘤胃微生物可以降解木质素，但相比其他营养成分，其降解率依然很小。而且由于木质素对纤维素、半纤维素的保护作用，致使瘤胃降解纤维素、半纤维素的酶无法充分接触到底物，从而影响了反刍动物对粗纤维的消化利用率。孙云章等[4]指出，在瘤胃消化过程中，黑麦草叶、黑麦草茎、稻草秸、花生壳几种饲草料中，随着木质素浓度的升高，其干物质消化率显著降低；Zhao等[5]用白腐真菌处理油菜秆30d，木质素降解了45%，体外发酵干物质消失率高于未处理油菜秆；Belyea等[6]以去木质素的苜蓿为试验组，发现其纤维素体外消化速度及程度都远高于对照组。以上研究都证明木质素浓度与饲草粗纤维及干物质消化率呈负相关。

木质素主要与半纤维素以酯键连接，少数与纤维素通过缩醛键和酯键连接。瘤胃微生物在降解纤维素、半纤维素时要先破坏其与木质素之间的化学键，而木质素浓度越高，化学键连接越紧密，粗纤维降解越困难，这是木质素之所以能阻碍粗纤维降解的更深层原因。

1.2 木质素单体组成对饲草粗纤维消化利用率的影响

除了木质素浓度影响饲草的消化利用率外，木质素单体组成也被认为是一个重要因素。针叶植物中主要含愈创木基单体（G,Guaiacyl），其中云杉木质素98%都是愈创木基单体；阔叶植物中主要为愈创木基单体和紫丁香基单体（S,Syringyl）；草类植物中除G、S型单体外，还含有较多的对-羟基苯基单体（H, p-Hydroxyphenyl）。木质素单体的组成不同，其抵抗瘤胃微生物降解的强度也不同。G型单体的聚合和交联相比S型单体更能阻碍初生细胞壁多糖的降解；不过G型单体较后者有更多的分枝，S型单体结构则更加线型，从而使之能够伸入次生细胞壁层，相比G型单体能更有效阻碍次生细胞壁被降解[7,8]。Davison等[9]和Fontaine等[10]分别指出由于玉米中较低水平的S单体木质素，因而用其饲喂动物能获得更高的肉、奶产出和饲料消化率。然而，Grabber等[11]用G、S单体培养玉米细胞壁发现，木质素组成的改变对纤维素、半纤维素多糖的降解没有影响。Li等[12]指出高水平的S单体浓度可促进拟南芥的化学降解率。以上研究结果不尽相同，原因可能是因为木质素单体组成对粗纤维降解的影响有时候会被木质素浓度的作用所覆盖，木质素浓度与木质素组成二者对粗纤维降解共同产生作用，因此考虑单一因素对纤维素的降解时，可能仅在一定程度内是统一的[13]。

木质素单体间的连接方式有β-O-4、β-5、β-β、5-5、5-O-4、α-O-4、β-1等键型[14]。不同的键型含量会随木质素单体组成而变化，根据Kishimoto等[15]的报道，S、G单体的存在均能促成β-O-4键型的生成，随着S单元增加，β-β键型含量增加，β-5和5-5键型含量降低。另据报道，S/G值与番茄、苜蓿、拟南芥的降解率呈负相关[16～18]，说明S/G值可能会通过影响键型含量影响饲草降解率，致使抵抗瘤胃微生物分解的不同键型含量发生变化，木质素被瘤胃微生物降解的难易程度也发生变化，从而影响了粗纤维乃至饲草的降解率。

1.3 非核心木质素阿魏酸交联对饲草粗纤维消化利用率的影响

非核心木质素主要指阿魏酸、二阿魏酸、对香豆酸等酚酸物质，香豆酸主要与木质素S单元γ位以酯键相连，极少同半纤维素多糖连接，因此常被看做木质化程度的指标。二阿魏酸一端与半纤维素阿拉伯糖残基5，-OH酯键相连，另一端与木质素单元醚键相连，是木质素与半纤维素间的桥梁，在草本植物中这类现象表现尤为明显。由于香豆酸只与核心木质素相连，不与半纤维素多糖相连，因此和半纤维素降解率之间没有相关关系，而二阿魏酸与半纤维素多糖连接，形成木质素-多糖复合体（LCC），阻碍了多糖相关酶对底物的接触，最终阻碍粗纤维的降解[7,19]。据Iiyama[20]报道，黑麦草干物质消化率与阿魏酸交联含量呈负相关（R2=0.5267）。饲草干物质降解率的降低，主要是源于粗纤维的耐分解性，木质素抑制粗纤维降解的原因，阿魏酸交联至少能解释一半，不过阿魏酸交联主要对半纤维素的降解有明显影响，对纤维素、果胶等影响甚微[11,21]。

2 提高木质素瘤胃降解率方法的研究进展

2.1 降解木质素的瘤胃微生物研究

自然界中降解木质素的酶主要有漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶，还有酯酶、过氧化氢酶、酚氧化酶等。目前，对瘤胃中与木质素降解有关的微生物和酶研究较少。邢岩[22]以木质素为唯一碳源从牛瘤胃微生物中筛选出两株木质素降解菌，经鉴定分别为大肠埃希氏菌和胡萝卜软腐果胶杆菌，两株菌均产阿魏酸酯酶和乙酰酯酶。漆酶是降解木质素最重要的一种酶，在动物中，对白蚁体内漆酶的报道较多[23]；在反刍动物中，利用奶牛瘤胃微生物宏基因组文库筛选得到了漆酶表达基因RF5[24]；在芒草驯化的湘西黄牛瘤胃微生物基因组文库中筛选得到了漆酶表达基因unlac134B2[25]。目前关于瘤胃微生物宏基因组中的漆酶表达基因报道很少，对瘤胃微生物中的产漆酶菌还没有报道，不过已有研究筛选出水牛瘤胃中木质素降解菌，经基因组测序发现与枯草芽孢杆菌同源性较高，枯草芽孢杆菌带有漆酶（cotA）基因，如该基因成功克隆并表达，将为研究瘤胃降解木质素的微生物做出贡献。据推测，通过基因工程的手段构建含木质素酶系基因的工程菌[26]，接种到瘤胃中可能会提高反刍动物对木质素的降解率，从而提高对粗纤维的消化利用率。但目前还没有此类研究报道。

2.2 基因工程技术对作物木质素的改造及其效应研究

提高瘤胃微生物对粗饲料干物质的消化率，关键在于提高对饲草粗纤维的消化率，而提高饲草粗纤维的消化率关键在于降低木质素浓度。参与木质素合成的酶有十几种，最重要的有COMT（咖啡酸-5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶）、CCoAOMT（咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶）、CAD（肉桂醇脱氢酶）、PAL（苯丙氨酸裂解酶）等，可通过对表达这几种酶的基因进行修饰，阻碍木质素的合成或改变其单体组成，来达到提高饲草消化率的目的。Guo等[27]下调COMT的量降低了木质素浓度，几乎使S型单体消失，下调CCoAOMT的量降低了木质素浓度且不改变S型单体含量，两种方法都提高了苜蓿的体外消化率。一般来说，下调COMT和CCoAOMT都会导致木质素浓度的下降，COMT缺乏可以使大部分S单元损失，S/G值降低，CCoAOMT缺乏倾向于使G单元大量损失，S/G值升高，总体上消化率都高于对照组[28～31]。可以肯定的是，木质素浓度和饲草消化率之间有很强的负相关性，但关于木质素单体组成对饲草消化率影响的大小以至有没有影响存在较多争议。Reddy等[32]、Chen等[33]、Vincent等[34]的研究中指出消化率的提高主要源于木质素浓度的降低，而与木质素S/ G值无关。而Vailh等[35]的研究发现在不改变木质素浓度的情况下，使S/G值下降10倍，提高了番茄5.6%的体外消化率。大多数研究表明，木质素浓度是影响饲草消化率的主要因素，木质素S/G值是次要因素，两者同时存在时，木质素浓度的影响可能会盖过S/G值的影响。

另外，Baucher[36]减少CAD降低了木质素浓度、S/ G值、S+G值，与Chen等[37]的报道一致，Vincent减少PAL降低了木质素浓度，总体上三者都提高了苜蓿或高羊茅或番茄的消化率。这说明能影响木质素浓度和木质素单体组成的酶不一而足，人为改造粗饲料作物的途径多种多样，这为科研工作者提供了更多的研究方向。

3 结语

理论上，在没有木质素存在的情况下，粗纤维可以完全被瘤胃微生物消化利用，因此减少木质素的负面作用就显得格外重要。木质素阻碍粗纤维降解的原因主要表现在木质素浓度、木质素单体组成、非核心木质素交联三个方面。当前通过改变瘤胃微生物表达酶提高饲草粗纤维降解率的研究还没有，重点研究侧重在如何令工程菌在瘤胃微生物菌群中成为优势菌群。通过改变饲料作物的木质素沉积来提高饲草消化率的报道较多，其中COMT、CCoAOMT、CAD、PAL是研究的热点，不过较大程度降低木质素浓度经常会影响饲料作物本身的生长、发育、生产，这需要提高警惕[38]。

[1] Buxton D R,Russell J R.Lignin Constituents and Cell-Wall Digestibility of Grass and Legume Stems[J].Crop Science,1988, 28(3):553-558.

[2] Kajikawa H,Kudo H,Kondo T,et al.Degradation of benzyl ether bonds of lignin by ruminal microbes[J].Fems Microbiology Letters, 2000, 187(1):15-20.

[3] 马振华.水牛瘤胃对不同粗饲料木质素降解率的研究[D].武汉:华中农业大学, 2015.

[4] 孙云章,毛胜勇,陈洁等.瘤胃厌氧真菌对木质素含量不同底物附着及发酵特性研究[J]. 草业学报, 2005, 14(3):56-61.

[5] Zhao X,Gong J,Zhou S.et al.Effect of Fungal Treatments of Rape Straw on Chemical Composition and in vitro Rumen Fermentation Characteristics[J]. Bioresources, 2014, 10(1).

[6] Belyea RL,Foster MB,Zinn GM.Effect of Delignification on In Vitro Digestion of Alfalfa Cellulose[J]. Journal of Dairy Science, 1983, 66(6):1277-1281.

[7] Davison BH,Drescher SR,Tuskan GA.Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis[J].Applied Biochemistry & Biotechnology, 2006, 129-132(1):427-35.

[8] Fontaine AS,Bout S,Barrière Y.Variation in cell wall composition among forage maize (Zea mays L.) inbred lines and its impact on digestibility: analysis of neutral detergent fiber composition by pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2004, 51(27):8080-7.

[9] Jung HG,Allen MS.Characteristics of plant cell walls affecting intake and digestibility of forages by ruminants[J].Journal of Animal Science, 1995, 73(9):2774-90.

[10] Deetz DA,Jung HJG,Helm RF.Impact of methyl 5‐O‐(E)‐feruloyl‐α‐L‐arabinofuranoside on in‐vitro degradation of cellulose and xylan[J].Journal of the Science of Food & Agriculture, 1992, 61(4):423-427.

[11] Li X,Ximenes E,Kim Y.et al.Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment[J].Biotechnology for Biofuels, 2010, 3(46):1-7.

[12] Soest PJV.Cell Wall Matrix Interactions and Degradation—Session Synopsis[J].Forage Cell Wall Structure & Digestibility, 1993.

[13] 蒋挺大.木质素[M].北京:化学工业出版社, 2009.

[14] Kishimoto T,Chiba W,Saito K.et al.Influence of Syringyl to Guaiacyl Ratio on the Structure of Natural and Synthetic Lignins[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2010, 58(2):895-901.

[15] Bernard-V MA,Cornu A,Robert D.Cell wall degradability of transgenic tobacco stems in relation to their chemical extraction and lignin quality[J].J.agric.food Chem, 1996, 44(4):1164-1169.

[16] Baucher M,Bernard MA,Vailhe B.Down-regulation of cinnamyl alcohol dehydrogenase in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) and the effect on lignin composition and digestibility[J].Plant Mol Biol 1999, 39:437-447.

[17] Goujon T,Ferret V,Mila I.Down-regulation of the AtCCR1 gene in Arabidopsis thaliana: effects on phenotype, lignins and cell wall degradability[J].Planta 2003, 217:218-228.

[18] Hartley RD.p-Coumaric and ferulic acid components of cell walls of ryegrass and their relationships with lignin and digestibility[J].Journal of the Science of Food & Agriculture, 1972, 23(11):1347-1354.

[19] Iiyama K.Structural characteristics of cell walls of forage grasses -their nutritional evaluation for ruminants - - review[J].Asian Australasian Journal of Animal Sciences, 2001, 14(6):862-879.

[20] Grabber JH,Mertens DR,Kim H.Cell wall fermentation kinetics are impacted more by lignin content and ferulate cross‐linking than by lignin composition[J].Journal of the Science of Food & Agriculture, 2009, 89(1):122-129.

[21] Grabber,John H.How Do Lignin Composition, Structure, and Cross-Linking Affect Degradability? A Review of Cell Wall Model Studies[J].Crop Science, 2005, 45(3):820-831.

[22] 邢岩.降解木质素厌氧菌株筛选及其转化秸秆作用研究[D].长春:吉林大学, 2012.

[23] Coy MR,Salem TZ,Denton JS.Phenol-oxidizing laccases from the termite gut[J].Insect Biochemistry & Molecular Biology, 2010, 40(10):723-32.

[24] Beloqui A,Pita M,Polaina J.Novel polyphenol oxidase mined from a metagenome expression library of bovine Rumen[J].Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(32):22933-42.

[25] 齐晶.芒草驯养牛瘤胃微生物Fosmid文库中漆酶新基因的克隆与特性初步研究[D].长沙:湖南农业大学, 2014.

[26] 符仙.构建含木质素酶系基因工程菌降解植物的木质素[D].海口:海南大学, 2013.

[27] Guo D,Chen F,Wheeler J.et al.Improvement of in-rumen digestibility of alfalfa forage by genetic manipulation of lignin O-methyltransferases[J].Transgenic Research, 2001, 10(5):457-64.

[28] Vignols F,Rigau J,Torres MA.et al.The brown midrib3 (bm3) mutation in maize occurs in the gene encoding caffeic acid O-methyltransferase[J].Plant Cell, 1995, 7(4):407-16.

[29] Mechin V,Argillier O,Menanteau V.et al.Relationship of cell wall composition to in vitro cell wall digestibility of maize inbred line stems[J].Journal of the Science of Food & Agriculture, 2000, 80(5):574-580.

[30] Piquemal J,Chamayou S,Nadaud I.et al.Down-regulation of caffeic acid O-methyltransf erase in maize revisited using a transgenic approach[J].Plant Physiology, 2003, 130(4):1675-85.

[31] Xu He,Mary Beth Hall,Maria Gallo-Meagher.et al.Improvement of Forage Quality by Downregulation of Maize Methyltransferase[J].Crop Science, 2003, 43(6):2240-2251.

[32] Reddy MSS,Dixon RA.Targeted down-regulation of cytochrome P450 enzymes for forage quality improvement in alfalfa (Medicago sativa L.) [J].PNAS, 2005, 102(46):16573-16578.

[33] Chen F,Dixon RA.Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production[J].Nature Biotechnology, 2007, 25(7):759-61.

[34] Vincent JH Sewalt,Weiting Ni,Hans G Jung.et al.Lignin Impact on Fiber Degradation: Increased Enzymatic Digestibility of Genetically Engineered Tobacco (Nicotiana tabacum) Stems Reduced in lignin content[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry, 1997, 45(5):1977-1983.

[35] Vailh MAB,Mign C,Cornu A.et al.Effect of modification of the O -methyltransferase activity on cell wall composition, ultrastructure and degradability of transgenic tobacco[J].Journal of the Science of Food & Agriculture, 1996, 72(3):385-391.

[36] Baucher M,Bernardvailh MA,Chabbert B.et al.Down-regulation of cinnamyl alcohol dehydrogenase in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) and the effect on lignin composition and digestibility[J].Plant Molecular Biology, 1999, 39(3):437-47.

[37] Chen L,Chung-Kyoon Auh,Paul Dowling.et al. Improved forage digestibility of tall fescue ( Festuca arundinacea ) by transgenic down-regulation of cinnamyl alcohol dehydrogenase[J].Plant Biotechnology Journal, 2003, 1(6):437-449.

[38] Jung HJ,Samac DA,Sarath G.Modifying crops to increase cell wall digestibility[J].Plant Science An International Journal of experimental plant biology, 2012, 185-186(185-186):65-77.

Effects of Lignin on Rumen Degradability of Rough Fibers and Advances in Methods to Improve Rumen Degradability of Lignin

XU Hao, LI Xiang
(College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)

The crude fiber content in the forage was negatively correlated with the ruminant digestibility of dry matter. In addition, lignin characterization affected the digestion of cellulose and hemicellulose. Therefore, lignin affected ruminant digestibility of the crude feed to a certain extent. This article reviewed the mechanism and solutions on lignin characterization limiting crude fiber digestion, and to provide reference for researchers.

Ruminant; Rumen microbes; Crude fiber; Lignin; Digestibility

S823.4

A

1004-4264（2017）04-0001-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.04.001

2016-11-04

“十二五”国家科技计划课题（2011BAD19B03）；中央高校基本科研业务费专项基金资助（2662016PY052）。

许浩（1992-），男，硕士生，研究方向为特种经济动物饲养。

李翔（1971-），男，副教授，研究方向为反刍动物营养。