新型绿色防腐剂乳酸链球菌素

徐俊进，金陈斌，陈小龙

(1.浙江工业大学 发酵工程研究所，浙江 杭州 310014； 2.浙江新银象生物工程有限公司，浙江 天台 317200)

新型绿色防腐剂乳酸链球菌素

徐俊进1,2，金陈斌1,2，陈小龙1*

(1.浙江工业大学 发酵工程研究所，浙江 杭州 310014； 2.浙江新银象生物工程有限公司，浙江 天台 317200)

乳酸链球菌素(Nisin)是一种安全有效的生物防腐剂。综述其结构、防腐机制、生产工艺、分离纯化与检测等领域的研究进展，并展望其未来发展，以期为相关研究提供参考。

Nisin； 发酵； 生物防腐剂； 防腐机制

乳酸链球菌素(Nisin)是某些乳链球菌(Streptococcuslactis)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)产生的抗菌短肽，能够有效抑制大多数革兰阳性细菌和部分革兰阴性菌，特别是对产孢子的芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、致死肉毒芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌等有很好的抑制作用。由于Nisin可由食品级微生物L.lactis发酵产生，因此，纯化后的Nisin与发酵液都能被用于食物中，且与其他细菌素相比，Nisin具有很高的抑菌活性，而且添加后不会引起食品任何感官变化，一旦进入人体，即可被人体内的胰凝乳蛋白酶降解，不致在体内残留，也不会在体内诱导产生致病的抗药性菌株，更不会与其他抗生素出现交叉抗性。自问世以来，Nisin被广泛用于乳制品的防腐保鲜等领域。由于具有广阔的市场效益和经济价值，Nisin自发现以来备受研究人员关注，是迄今被研究得最为彻底的一种细菌素[1]。

1 Nisin的结构

Nisin有3种天然异构体，Nisin A、Nisin Z和Nisin Q。其中，Nisin A和Nisin Z均由34个氨基酸组成，在结构上只有1个氨基酸不同，即第27位氨基酸残基，Nisin A为组氨酸残基，而Nisin Z为天冬酰胺残基。Nisin Q是新近发现的天然异构体，其结构与Nisin A和Nisin Z分别有3个和4个氨基酸的差异。

Nisin分子常以二聚体或四聚体的形式存在。Nisin分子中含有一些修饰性的氨基酸残基，包括β-甲基羊毛硫氨酸(β-methyllanthionine)、羊毛硫氨酸(Lanthionine)、脱氢丙氨酸(Dehydroalanine，Dha)和甲基脱氢丙氨酸(Dehy drobutyrine，Dhb)。Nisin A高级结构中含5个有别于其他蛋白质的硫醚键，这些硫醚键构成了5个环状结构。Nisin A分子在肽链的C端和N端的顶端区还具有一定的可弯曲性[2]。

2 Nisin的防腐机制

2.1 Nisin的抑菌机制

Nisin的抑菌谱很广，包括乳球菌、葡萄球菌、链球菌、微球菌、乳杆菌、片球菌属、李斯特菌、分枝杆菌等革兰阳性细菌，特别是对芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌的抑制效果特别明显。而且，Nisin对这些细菌的孢子比对其营养细胞更敏感[3]。一些研究认为，Nisin可以使细菌细胞膜上形成孔洞，打破质子动力平衡和pH平衡，导致离子泄漏和ATP的水解，从而导致细胞死亡。也有研究表明，Nisin会捆绑Lipid II，而Lipid II是肽聚糖的前体，从而抑制细胞壁的合成[4]。许多革兰阴性细菌之所以能够抵抗Nisin的抑制作用，可能就是因为其细胞壁外层的脂多糖(LPS)充当了屏障的作用，从而有效地阻挡了Nisin对细胞膜的伤害。一旦加入EDTA，即可螯合、限制LPS中的Mg2+和Ca2+，达到对LPS的去稳定作用，之后，Nisin就能够突破屏障，作用于细胞膜上发挥作用[5]。Penna等[6]研究认为，Nisin抑制大肠埃希菌孢子的作用机理是，Nisin与蛋白质上的硫氢基结合，使孢子内含硫氢基的酶失活，且在高温灭菌的同时搭配使用Nisin，会大幅度提高灭活大肠埃希菌孢子的效率[7]。目前极少数革兰阳性细菌已经表现出对Nisin的抗性，这是因为其合成了一种叫Nisinase的酶，从而导致Nisin失活[8]。

2.2 影响Nisin防腐性的因素

Nisin的抗菌活性和稳定性受许多化学和物理因素的影响，如pH、盐浓度和温度等。其中，pH是一个非常重要的影响因素。Nisin的抗菌活性随pH升高而下降，溶解度也随之下降。pH>7时，Nisin几乎不溶于水。另外，Nisin的稳定性与溶液的pH有关。当溶液的pH值<3时，高温加热条件下，Nisin的抗菌活性基本上不发生改变；而当溶液的pH值>4时，加热条件下，Nisin的抗菌活性会迅速消失。另有研究显示，当Nisin与其他适合的条件联合作用时，其抗菌活性能大幅度提高，如适当的冷冻、盐处理、热处理和酸味剂等[9]。

Nisin分子含有疏水残基，因此具有脂水两亲的性质，所以Nisin最好不要用于肉类食品防腐保鲜。因为肉中油脂很多，会溶解Nisin并与之发生作用，从而降低Nisin的抑菌能力。有焦亚硫酸钠或二氧化钛存在时，Nisin也会因分解而失活[1]。

3 Nisin的生产方法

3.1 发酵法

通过流动的牛奶或乳清培养L.lactis，再进行固液分离，将液体喷雾干燥，收集干燥后的粉末就可作为商品出售。但该方法制得的Nisin纯度低[10](产物包括2.5%的Nisin、72.0%的NaCl、23.8%的牛乳固形物、1.7%的水分)，且Nisin活性浓度仅为1×106IU·g-1(1 g纯的Nisin活性单位为40×106IU)。因此，现在很多研究利用膜分离技术与分批发酵相结合，以提高产品中Nisin的浓度，降低成本。

L.lactis在发酵生产Nisin的过程中会产生乳酸，而乳酸的积累会引起发酵液pH下降，进而抑制L.lactis的正常生长。通常采用在发酵培养基中加碱中和或用有机溶剂提取乳酸的办法来调节pH，但是加入碱之后生成的乳酸盐对L.lactis的生长也会产生抑制作用。基于以上考虑，华盛顿州立大学的Liu等[11]提出，将产Nisin的L.lactis与酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)混合培养来生产Nisin。其原理是，L.lactis在发酵生产Nisin的过程中所产生的乳酸可以被S.cerevisiae利用，而S.cerevisiae在代谢过程中所产生的一些物质又可以被L.lactis作为底物进行利用，2种菌种的相互作用，构成了一个有利于Nisin生产的微生态环境。该研究团队以乳清作为基础培养，将相同培养条件下的混菌发酵与常规发酵进行对比。结果显示，对比常规发酵81.2 mg·L-1的Nisin终浓度，混菌发酵条件下达到了150.3 mg·L-1，增加了85%。另外，利用基因工程技术提高菌种自身的Nisin耐受能力与生产能力也是一种降低成本的重要方法。

3.2 化学法

先合成脱氢丙氨酸与羊毛硫氨酸这2种特殊氨基酸，然后合成硫醚环，再将5个硫醚环片段以缩合反应连接，即可形成完整的Nisin分子，经测试，其抑菌效果与天然的Nisin相同。

4 Nisin的分离纯化与检测

目前，Nisin的分离纯化主要采用离子交换膨胀床、亲和层析和高效液相层析等方法。但这些方法成本都比较高，而且会引入很多不适于食品添加的化合物。因此，一般还是采用先乙醇抽提，再用硫酸铵沉淀或pH值2.0酸沉淀的方法来分离纯化Nisin[12]。

目前，针对细菌素活性的检测方法有很多，其中最简单、最常用的方法是琼脂平板扩散法、牛津杯法和划线法等。下面着重介绍琼脂平板扩散法：将灭好菌的效价培养基冷却至约45 ℃，加入0.5%的Tween-20和2%指示菌菌悬液，摇匀，准确吸取20 mL该培养基加入水平放置的培养皿内，凝固后用直径8 mm的中空打孔器在平板上打出孔洞，加入含Nisin发酵液(充满孔洞)或经稀释的样液，盖上皿盖，静置0.5 h，移至30 ℃培养箱内培养24 h，测量抑菌圈直径[13]。

5 研究展望

我国L.lactis菌种资源丰富，但目前在Nisin的研究领域还处于初级阶段，生产规模小，发酵水平低，成本高，应用不广泛。今后，应大力进行Nisin的基础研究和开发应用，利用生物技术(如基因工程、蛋白质工程、细胞工程等)研发优良工程菌株。通过对Nisin的性质及作用机理的进一步研究，拓展并加速其作为天然生物防腐剂在食品等行业中的应用。

[1] LUCIANAJUNCIONIDE A, ANGELAFAUSTINO J, PRISCILAGAVA M, et al. Nisin biotechnological production and application: a review[J]. Trends in Food Science & Technology, 2009, 20(3/4): 146-154.

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[13] 张国只, 陈林海, 杨天佑, 等. 琼脂扩散法测定乳链菌肽效价的优化[J]. 食品科学, 2007, 28(3):175-178.

(责任编辑：高 峻)

2017-03-20

徐俊进(1963—)，男，浙江天台人，学士，工程师，主要从事生物防腐剂的生产与研究工作，E-mail：973738378@qq.com。

陈小龙(1970—)，男，浙江仙居人，博士，教授，主要从事生物活性物质的生产与研究工作，E-mail：richard_chen@zjut.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170630

TS202.3

B

0528-9017(2017)06-1005-03

文献著录格式：徐俊进，金陈斌，陈小龙. 新型绿色防腐剂乳酸链球菌素[J].浙江农业科学，2017，58(6)：1005-1007.