丹参水溶性有效成分对内皮祖细胞功能的影响

杨锦秀,毛 威

(浙江中医药大学附属第一医院心内科, 浙江 杭州 310006)

丹参水溶性有效成分对内皮祖细胞功能的影响

杨锦秀,毛 威

(浙江中医药大学附属第一医院心内科, 浙江 杭州 310006)

丹参水溶性有效成分具有广泛的生理活性与药理作用。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一类具有高增殖潜能并能分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。研究发现丹参水溶性有效成分可通过调节EPCs功能来修复内皮损伤，从而在内皮损伤相关性疾病中发挥保护及治疗作用。该文综述了丹参水溶性有效成分对EPCs功能的影响，从而为丹参水溶性有效成分的进一步开发利用提供依据。

丹参；水溶性；成分；内皮祖细胞；功能；影响

丹参(SalviamiltiorrhizaBge)为唇形科鼠尾草属植物，分为水溶性及脂溶性2种有效成分。丹参水溶性有效成分具有扩张血管、改善微循环、抗血栓形成和抗脂质氧化等药理作用。目前，以丹参水溶性有效成分为主要成分的丹参注射液已广泛应用于临床心脑血管疾病的防治。近年来研究表明，丹参对各种因素引起的内皮损伤有明显的保护作用。内皮细胞起着维持内皮正常功能的重要作用，其功能紊乱及损伤贯穿心脑血管疾病发生发展的各个环节。由于内皮细胞增殖能力弱、不能远距离迁移等特性限制了它在心脑血管疾病治疗方面的应用，而内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的发现则弥补了这一不足。EPCs又称血管内皮干细胞或成血管细胞，是一类具有高增殖潜能的前体细胞，可被诱导分化为成熟的血管内皮细胞。丹参水溶性有效成分可能通过增强EPCs的功能来发挥保护内皮功能的作用。为此，本文就丹参水溶性有效成分对EPCs功能的影响予以总结，综述如下。

1 丹参水溶性有效成分的特性

丹参为唇形科多年生草本植物丹参的干燥根茎，其味苦，药性微寒，丹参是临床上应用广泛的一种中药，具有促进血管新生、改善微循环、抗心肌缺血、抗血小板活化、抗炎及降血脂等药理作用，丹参在临床上广泛应用于心脑血管疾病的防治[1-2]。近来研究表明[3]，丹参对动脉粥样硬化早期的内皮损伤具有明显的保护作用。丹参的化学成分可分为水溶性和脂溶性两大类，水溶性成分主要为酚酸类化合物，包括丹参素、丹参酚酸(A、B、C、D、E、F、G)、丹参酸(乙、丙)、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、原儿茶酸及原儿茶醛等[4-5]。目前，丹参主要以水煎煮的方式用于临床治疗疾病，其有效成分主要以水溶性为主。丹参素及丹参酚酸类是丹参提取物中最重要的水溶性有效成分。最早发现的丹参素化学名为f-3,4-二羟本乳酸，而丹参酚酸是丹参中含量最丰富的水溶性物质，既有咖啡酞缩酚酸结构，又有新木脂素骨架，包括丹参酚酸A、B、C、D、E、F、G、H、I等，其中含量最高的两个成分丹参酚酸A和丹参酚酸B活性最强。丹参素及丹参酚酸类其强大的抗脂质过氧化和清除自由基作用等能力均强于脂溶性成分，从而能更好地发挥保护内皮功能的作用。

2 EPCs的生物学特性

目前认为，EPCs与造血干细胞都来源于前体细胞成血管细胞，两者共同起源于胚胎期胚外中胚层的卵黄囊血岛。生理情况下，体内EPCs的数量很少，外周血中为2～3个/mL，脐血中的数量约为外周血的3.5倍，骨髓中所占比例最大[6]。目前尚无特异性表面标志来鉴定EPCs，用于鉴定EPCs的表面标志物也存在于造血干细胞和循环内皮细胞上。学术界通常用CD34、CDl33、VEGFR-2等表面标志物来鉴定EPCs[7]。CD34+/CD133+/VEGFR-2+细胞具有较强的分化为成熟内皮细胞的能力，能够促进出生后的血管形成。同时表达CD34、CDl33和VEGFR-2的EPCs释放入外周血后CD34表达下调，CD133逐渐消失，而VEGFR-2能持续表达。培养7 d后的EPCs可用DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)和FITC标记的荆豆凝集I(FITC-UEA-I)的双荧光染色鉴定，DiI-ac-LDL阳性EPCs显示的是红色荧光(细胞内吞作用)，而FITC-UEA-I阳性EPCs显示的是绿色荧光(细胞膜结合表达)，显示黄色的双荧光染色阳性EPCs即为正在分化的EPCs[8-10]。

根据EPCs的特性可分为2种：早期EPCs和晚期EPCs。早期EPCs贴壁较晚，形似簇状，并开始加长类似纺锤形，约4周后死亡，增殖能力低[11-12]。早期EPCs主要表达CD34、CDl33和VEGFR-2，在体外不能形成血管样结构，但能黏附在内皮细胞表面，通过旁分泌促血管生成的细胞因子促进血管再生及修复损伤的内皮功能[12]。晚期EPCs贴壁较早，呈鹅卵石样，2～3周后增殖并分化为成熟的内皮细胞，能表达vWF、VE-钙黏素、E-选择素，产生更多的一氧化氮，能直接整合到新生血管中参与血管新生[13-14]。因此，EPCs是由众多处于不同分化阶段的细胞组成，是一组异质性的细胞群体，它的特性随时间改变而变化。

3 丹参水溶性有效成分对EPCs作用

3.1增殖功能细胞增殖功能对维持细胞数量的平衡和功能的稳定起关键作用，是细胞重要的生物功能。目前研究发现，丹参素能促进EPCs增殖功能。丹参素(5、10、20 mg·L-1)干预72 h可促进外周血来源EPCs扩增，并明显增强其增殖能力[15]。氧化低密度脂蛋白可使外周血EPCs的增殖能力明显受损，加用丹参素(2、10、50 mg·L-1)干预24 h后，明显改善了EPCs的增殖能力[16]。陆广汇[17]研究发现，丹参素能剂量依赖性和时间依赖性地促进EPCs的增殖, 其作用在0.8 mg·L-1、72 h的时候达到高峰。同时，亦有研究者探讨水溶性丹参酚酸类对EPCs增殖能力的影响。研究发现，丹参酚酸A能促进缺血心肌的血管新生，增加EPCs数量[18]。谭俊珍等[19]研究发现，丹参酚酸B(8 mg·L-1)能增强EPCs增殖能力。赵桂峰等[20]发现，丹参多酚酸盐(8 mg·L-1)干预24 h能促进EPCs的增殖，增加外周血EPCs数量，保护缺血损伤的心肌。近期研究亦发现，丹参酚酸B(0.5、2.5、5、10 mg·L-1)干预24 h能增强人外周血EPCs的增殖能力[21]。蒋宇[22]则认为，丹参酚酸B对EPCs作用与浓度有关，低浓度(0.2、0.4、0.8、1.6 mg·L-1)干预24 h能改善人外周血EPCs的增殖能力，而高浓度丹参酚酸B(8.0 mg·L-1)则减弱EPCs的增殖能力，可能与其潜在的细胞毒性有关，尚需进一步的研究证实。

3.2迁移功能细胞迁移功能是细胞基本功能之一，在血管新生、损伤修复、免疫反应等过程中起重要作用。肖刚峰等[15]研究发现，丹参素(5、10、20 mg·L-1)干预72 h可明显改善外周血EPCs的迁移功能。陆广汇[17]则发现，0.4、0.8、1.6 mg·L-1丹参素作用24 h也能改善EPCs的迁移功能。另一类丹参水溶性成分中丹参酚酸A被证实能促进缺血心肌的血管新生，增强EPCs的迁移功能[18]。丹参酚酸B(8 mg·L-1)亦被发现能增强EPCs迁移能力[19]。Tang等[23]则进一步研究发现丹参酚酸B增强人骨髓来源EPCs迁移功能，能通过调节Akt/mTOR/4EBP1、p38 MAPK/ATF2和ERK1/2信号通路保护氧化应激条件下的EPCs。蒋宇[22]则发现，丹参酚酸B对EPCs迁移能力的影响与浓度有关，低浓度(0.2、0.4、0.8、1.6 mg·L-1)干预24 h能增强人外周血EPCs的迁移能力，而高浓度(8.0 mg·L-1)则减弱EPCs的迁移能力。综上所述，高浓度的丹参酚酸B减弱细胞迁移能力可能与其潜在的细胞毒性有关。

3.3黏附功能研究发现，丹参素能增强EPCs黏附功能。肖刚峰等[15]发现，丹参素(5、10、20 mg·L-1)干预72 h可明显改善外周血EPCs的黏附能力。丹参素不仅增强正常EPCs的黏附能力，还能修复受损EPCs的黏附能力。研究发现，氧化低密度脂蛋白损伤后，外周血EPCs的黏附能力明显受损，丹参素(2、10、50 mg·L-1)干预24 h后，明显改善了EPCs的黏附能力[16]。 陆广汇[17]则发现，0.4、0.8、1.6 mg·L-1丹参素作用24 h也能改善EPCs的黏附功能。近期亦有研究发现丹参酚酸B能改善EPCs的黏附功能。谭俊珍等[19]发现，丹参酚酸B(8 mg·L-1)能增强EPCs黏附能力。严凤娣[21]也发现，丹参酚酸B(0.5、2.5、5、10 mg·L-1)干预24 h能改善人外周血EPCs的黏附能力。蒋宇[22]则认为，丹参酚酸B(0.2、0.4、0.8、1.6 mg·L-1)作用24 h能改善人外周血EPCs的黏附能力，而高浓度丹参酚酸B(8.0 mg·L-1)则减弱其黏附能力。

3.4成血管功能EPCs成血管功能与增殖、黏附及迁移功能密切相关，丹参水溶性成分对EPCs增殖、黏附及迁移能力的促进作用也能增强EPCs成血管功能。研究发现，丹参酚酸A能增强EPCs的成血管功能，促进缺血心肌的血管新生[18]。丹参酚酸B亦能增强EPCs成血管功能。谭俊珍等[19]发现，丹参酚酸B(8 mg·L-1)通过促进血管新生，改善心肌微环境，从而上调心肌细胞早期基因的表达。Tang等[23]研究发现，丹参酚酸B增强人骨髓来源EPCs成血管功能，能通过调节Akt/mTOR/4EBP1、p38 MAPK/ATF2和ERK1/2 信号通路保护氧化应激条件下的EPCs。陈琴等[24]则发现，晚期糖基化修饰的白蛋白促进EPCs凋亡及糖基化终产物受体表达，减弱其体外血管形成能力，丹参多酚酸盐1、10 mg·L-1共培养24 h能修复由晚期糖基化修饰的白蛋白引起的EPCs功能损害。

3.5旁分泌功能EPCs旁分泌保护性细胞因子对于自身功能的维持及其修复作用的发挥起着重要的作用，同时，EPCs旁分泌炎症因子则能损伤细胞功能。丹参水溶性有效成分可通过促进保护性细胞因子分泌及抑制炎性因子释放来保护EPCs的功能。氧化低密度脂蛋白损伤后，EPCs的细胞培养液中白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量明显增高，而丹参素(2、10、50 mg·L-1)干预24 h后，明显降低细胞培养液中IL-6及TNF-α含量[16]。认为丹参素对氧化低密度脂蛋白损伤后EPCs功能的保护可能与抑制炎症因子释放有关。陈琴等[24]发现，晚期糖基化修饰的白蛋白促进EPCs凋亡及糖基化终产物受体表达，减弱其内皮型一氧化氮合成与Akt的表达，丹参多酚酸盐1、10 mg·L-1共培养24 h能修复由晚期糖基化修饰的白蛋白引起的EPCs功能损害。薛亮等[25]则发现，8 mg·L-1丹参酚酸B干预24 h能使EPCs 血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子mRNA的表达量增加，同时促进细胞分泌超氧化物歧化酶，从而增强其处理自由基能力。近期，严凤娣等[21]亦发现，丹参酚酸B(0.5、2.5、5、10 mg·L-1)干预24 h能改善人外周血EPCs分泌一氧化氮的能力。

4 总结与展望

丹参水溶性有效成分具有保护内皮、扩张血管、改善微循环、抗脂质氧化及抗血栓形成等生物活性。其中对内皮功能的保护是丹参水溶性有效成分发挥作用的重要环节。丹参最重要两种水溶性有效成分丹参素及丹参酚酸A、B可通过增加EPCs的数量并改善其增殖、迁移、黏附、成血管功能，促进保护性细胞因子分泌及抑制炎性因子释放，促进内皮修复，从而对内皮损伤相关疾病发挥保护及治疗作用。至今，EPCs尚无特异性表面标记物，需要进一步研究予以明确。目前关于丹参水溶性有效成分对EPCs功能影响的研究主要为体外实验，尚需更多的体内实验，尤其是临床试验予以证实。另外，目前的研究主要是现象观察，缺乏对潜在机制的进一步深入研究。丹参水溶性有效成分更容易制作成注射液，相信随着基础及临床研究的进一步开展，必将具有更广泛的临床应用前景。

[1] 林 超, 刘兆国, 钱 星, 等. 丹酚酸B在心血管疾病中药理作用研究进展[J]. 中国药理学通报, 2015,31(4):449-52.

[1] Lin C, Liu Z G, Qian X, et al. Research progress of salvianolic acid B in cardiovascular diseases[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(4):449-52.

[2] 崔国祯, 徐燕玲, 孙安露, 等. 丹参素衍生物对斑马鱼促血管新生作用的研究[J]. 中国药理学通报, 2016,32(6):795-800.

[2] Cui G Z, Xu Y L, Sun A L, et al. Effect of Danshensu derivative on angiogenesis in zebrafish[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(6):795-800.

[3] 杨艳丽, 姚成芳. 丹参水溶性成分对胶原酶诱导的内皮损伤保护作用[J]. 济宁医学院学报, 2012,35(3):173-6.

[3] Yang Y L, Yao C F. Protective effect of the water-soluble ingredients of salvia miltiorrhiza on collagenase-induced endothelial injury[J].JJiningMedUniv, 2012,35(3):173-6.

[4] Zhou L, Chow M, Zuo Z. Improved quality control method for Danshen products consideration of both hydrophilic and lipophilic active components[J].JPharmBiomedAnal, 2006,41(3):744-50.

[5] 刘慧颖, 姜长涛, 冯 娟, 等. 丹参酮类化合物研究进展[J]. 中国药理学通报,2016,32(12):1643-7.

[5] Liu H Y, Jiang C T, Feng J, et al. Research progress of Tanshinones[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(12):1643-7.

[6] Martínez-Estrada O M, Muoz-Santos Y, Julve J, et al. Human adipose tissue as a source of Flk-1(+) cells: new method of differentiation and expansion[J].CardiovascRes, 2005,65(2):328-33.

[7] Urbich C, Dimmeler S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology[J].CircRes, 2004,95(4):343-53.

[8] Yang J X, Chen B, Pan Y Y, et al. Zoledronate attenuates angiogenic effects of angiotensin Ⅱ-stimulated endothelial progenitor cells via RhoA and MAPK signaling[J].PLoSOne, 2012,7(10):e46511.

[9] Wang X X, Yang J X, Pan Y Y , et al. Protective effects of tanshinone ⅡA on endothelial progenitor cells injured by tumor necrosis factorα[J].MolMedRep, 2015,12(3):4055-62.

[10]Yang J X, Pan Y Y, Ge J H, et al. Tanshinone ⅡA attenuates TNF-α-induced expression of VCAM-1 and ICAM-1 in endothelial progenitor cells by blocking activation of nuclear factor κB[J].CellPhysiolBiochem, 2016,40(1-2):195-206.

[11]Hur J, Yoon C H, Kim H S, et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis[J].ArteriosclerThrombVascBiol, 2004,24(2):288-93.

[12]Sieveking D P, Buckle A, Celermajer D S, et al. Strikingly different angiogenic properties of endothelial progenitor cell subpopulations: Insights from a novel human angiogenesis assay[J].JAmCollCardiol, 2008,51(6): 660-8.

[13]Lin Y, Weisdorf D J, Solovey A, et al. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood[J].JClinInvest, 2000,105(1):71-7.

[14]Marsboom G, Janssens S. Endothelial progenitor cells: new perspectives and applications in cardiovascular therapies[J].ExpertRevCardiovascTher, 2008,6(5):687-701.

[15]肖刚峰, 张怀勤, 黄晓燕, 等. 丹参的两种主要成分对培养内皮祖细胞药理作用研究[J]. 中医药学刊, 2006,24(6):1035-7.

[15]Xiao G F, Zhang H Q, Huang X Y, et al. Effects of two ingredients of Danshen on number and activity of endothelial progenitor cellinvitro[J].ChinArchTraditChinMed, 2006,24(6):1035-7.

[16]Ji K T, Chai J D, Xing C, et al. Danshen protects endothelial progenitor cells from oxidized low-density lipoprotein induced impairment[J].JZhejiangUnivSciB, 2010,11(8):618-26.

[17]陆广汇. 丹参素对外周血内皮祖细胞增殖、粘附和迁移功能的影响[J]. 中国医药导刊, 2012,14(S2):784-5.

[17]Lu G H. The effect of Danshensu on proliferation, adhesion and migration of endothelial progenitor cells from peripheral blood[J].ChinJMedGuide, 2012,14(S2):784-5.

[18]Li Y J, Duan C L, Liu J X. Salvianolic acid A promotes the acceleration of neovascularization in the ischemic rat myocardium and the functions of endothelial progenitor cells[J].JEthnopharmacol, 2014,151(1):218-27.

[19]谭俊珍, 李庆雯, 南亚昀, 等. 丹酚酸B预处理内皮祖细胞在大鼠骨髓间充质干细胞分化过程中对心肌早期基因表达的影响[J]. 中国中西医结合杂志, 2009,29(6):529-32.

[19]Tan J Z, Li Q W, Nan Y Y, et al. Effects of Salvianolic acid B preconditioning endothelial progenitor cells on expressions of myocardial genes in bone mesenchymal stem cells at the early cell differentiation stage of rats[J].ChinJIntegrTraditWestMed, 2009,29(6):529-32.

[20]赵桂峰, 范英昌, 姜希娟. 丹酚酸B对内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞联合心脏移植后增殖状况的影响[J]. 中国中西医结合杂志, 2012,32(5):671-5.

[20]Zhao G F, Fan Y C, Jiang X J. Effects of the proliferation state of the endothelial progenitor cells preconditional with Salvianolic acid B and bone marrow mesenchymal stem cells transplanted in acute myocardial infarction rats[J].ChinJIntegrTraditWestMed, 2012,32(5):671-5.

[21]严凤娣, 何胜虎, 张 晶. 丹参多酚酸盐对外周血内皮祖细胞功能的影响[J]. 中华临床医师杂志, 2014,8(24):4436-9.

[21]Yan F D, He S H, Zhang J. Effects of salvianolic acid on human peripheral endothelial progenitor cellsinvitro[J].ChinJfClin, 2014,8(24):4436-9.

[22]蒋 宇. 丹参酚酸B对外周血内皮祖细胞增殖、粘附和迁移功能的影响[J]. 中国民族民间医药, 2012,22(1):16-7.

[22]Jiang Y. The effect of Salvianolic acid B on proliferation, adhesion and migration of endothelial progenitor cells from peripheral blood[J].ChinJEthnomedEthnopharm, 2012,22(1):16-7.

[23]Tang Y, Jacobi A, Vater C, et al. Salvianolic acid B protects human endothelial progenitor cells against oxidative stress-mediated dysfunction by modulating Akt/mTOR/4EBP1, p38 MAPK/ATF2, and ERK1/2 signaling pathways[J].BiochemPharmacol, 2014,90(1):34-49.

[24]陈 琴, 黄铭涵, 江时森, 等. 丹参多酚酸盐修复糖基化终产物引起的晚期EPCs功能障碍及其分子机制[J]. 中国中西医结合杂志, 2010,30(6):630-5.

[24]Chen Q, Huang M H, Jiang S S, et al. Effect of depside salt from Salvia Miltiorrhizae in repairing advanced glycation end products-induced late endothelial progenitor cell dysfunction and its molecular mechanism[J].ChinJIntegrTraditWestMed, 2010,30(6):630-5.

[25]薛 亮, 范英昌, 李庆雯, 等. 丹酚酸B对离体培养内皮祖细胞VEGF、bFGF mRNA表达及抗氧化酶活性的影响[J]. 中国老年学杂志, 2011,31(2):236-8.

[25]Xue L, Fan Y C, Li Q W, et al. The influence of Sal B on cytokine mRNA expression and activity of antioxidant enzymes of the endothelial progenitor cellsinvitro[J].ChinJGerontol, 2011,31(2):236-8.

EffectsofhydrosolubleactiveconstituentofSalviamiltiorrhizaBgeonendothelialprogenitorcellfunctions

YANG Jin-xiu, MAO Wei
(DeptofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China)

The hydrosoluble active constituent of Salvia miltiorrhiza Bge has a wide range of physiological activities and pharmacological effects. Endothelial progenitor cells(EPCs) comprise a cell population that has the capacity to circulate, proliferate and differentiate into mature endothelial cells but that has not yet acquired characteristic mature endothelial markers nor formed precursor cells of blood vessels. It was found that the hydrosoluble active constituent of Salvia miltiorrhiza Bge could protect endothelial functions through modulation of EPCs functions, thus exerting therapeutic effects in endothelium injured related diseases. This paper reviewed the effects of the hydrosoluble active constituent of Salvia miltiorrhiza Bge on EPCs functions. We hope that the paper could provide a reference for further utilization of hydrosoluble active constituent of Salvia miltiorrhiza Bge.

Salvia miltiorrhiza Bge; hydrosolubility; constituent; endothelial progenitor cells; function; effect

时间：2017-8-20 16:47 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.010.html

2017-05-28,

2017-07-01

国家自然科学基金资助项目(No 81400192)

杨锦秀(1983-)，男，博士，主治医师，研究方向：内皮祖细胞与血管重构，E-mail:zihuidaoren@163.com； 毛 威(1965-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：冠心病基础及中西医结合治疗，通讯作者，E-mail:maoweilw@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.005

A

：1001-1978(2017)09-1203-04

R284.1；R322.12；R329.24