分子印迹技术在蜂产品中的研究进展（续）

陈长宝刘新迎汪建民牛华星王士强秦浩然尹旭升

(1山东农业大学化学与材料科学学院，泰安271018；2山东省蜂业良种繁殖推广中心，泰安271000；3山东省兽药质量检验所)

分子印迹技术在蜂产品中的研究进展（续）

陈长宝1刘新迎2汪建民1牛华星3王士强2秦浩然2尹旭升2

(1山东农业大学化学与材料科学学院，泰安271018；2山东省蜂业良种繁殖推广中心，泰安271000；3山东省兽药质量检验所)

（续《中国蜂业》2017年第7期）

3.2 咖啡酸苯乙酯

咖啡酸苯乙酯是天然存在的一种多酚类化合物，其分子结构中的儿茶酚环是一种常见的自由基清除结构。因此，对菇类资源中咖啡酸苯乙酯的探索以及其抗氧化机制的研究有一定的应用价值。李宁[29]以咖啡酸苯乙酯为印迹分子，4-乙烯吡啶为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，四氢呋喃和异辛烷的混合溶液作为致孔剂合成MIPs。实验考察了MIPs对印迹分子咖啡酸苯乙酯和结构类似物咖啡酸的选择性，并通过吸附动力学和吸附等温线对聚合物进行表征。将咖啡酸苯乙酯分子印迹聚合物作为固相萃取的吸附材料，从25种菇类中分离富集咖啡酸苯乙酯和咖啡酸。实验结果表明，从7种菇类中检测到咖啡酸的存在，含量在0.004～0.340 μg·g-1。此外，与商品化 C18 柱相对比，分子印迹柱对目标物表现出较好的亲和性和选择性，该方法应该能够用于蜂胶中咖啡酸苯乙酯等类似物的检测分析。

3.3 白杨素

白杨素又称白杨黄素，在蜂胶中具有较高的含量，是合成抗癌、抗菌和消炎等药物的原料之一。马红玲[30]以白杨素为印迹分子、丙烯酰胺为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为交联剂、环氧氯丙烷为亲水调节剂、和DMF/甲醇为混合溶剂，采用沉淀聚合法制备了具有亲水性能的开环MIPs，采用静态吸附、动态吸附对MIPs的吸附性能进行了评价。结果表明开环MIPs微球对印迹分子呈现出了较好的结合能力，另外又测定了其亲水性，实验结果表明开环MIPs的亲水性能得到了显著提高。

4 MIT在蜂毒中的应用

4.1 蜂毒肽

蜂毒素（也称为蜂毒溶血肽，即蜂毒肽，Melittin)占蜂毒干重的50%以上，由26个氨基酸组成，相对分子质量2984，不含二硫键，是蜂毒中的主要活性物质，具有抗菌、抗辐射和非常显著的抗炎镇痛作用，是迄今为止人类所知的抗炎活性最强的物质之一。Hoshino Y等[32]首先采用过水相沉淀聚合法制备蜂毒肽（26个氨基酸单元）印迹纳米粒子。聚合单体包括作为骨架单体的N-异丙基丙烯酰胺和不同性质的其他功能单体，其中含有40%（wt）的疏水性N-叔丁基丙烯酰胺，这样所得共聚物有较低的下限临界溶解温度，故室温下就可通过自由基引发沉淀聚合。溶液中还加入了少量的十二烷基硫酸钠以抑制生成纳米粒子的聚集。纳米蛋白质MIPs有望用于药物设计和合成。许多疾病与酶的活性相关，很多基于小分子化合物的酶抑制剂已用于这些疾病的治疗，但存在的普遍问题其对目标酶的选择性低。其次Hoshino Y等[31]在动物体内的研究也取得了突破性的进展。他们制备了蜂毒素印迹纳米粒，并首次作为解毒剂将其运用于小鼠体内，印迹纳米粒经鼠尾静脉注射后可与蜂毒素结合，在进入肝脏后被巨噬细胞摄取，起到解毒的功效。实验表明，注射了印迹纳米粒的小鼠存活率远高于其对照组。研究结果表明，当分子印迹聚合物颗粒中包含适量的N-(1,1-二甲基乙基)-2-丙烯酰胺和丙烯酸时，聚合物表现出较强的结合蜂毒素的能力；当其Kd值是25 pmol·L-1时，非常接近蜂毒素自然抗体的Kd值17 pmol·L-1。该项研究首次实现了在体内环境中捕捉并中和蜂毒素，起到了和单克隆抗体相同的作用，这一方法的实现揭开了分子印迹技术在生物医学领域的应用新篇章。并将其成功用于小鼠体内蜂毒素的捕获和中和，起到了解毒效果，这将MIPs在体内的应用推向了新的范畴。Hoshino Y[33]还将蜂毒肽印迹纳米粒子通过静脉注射进白鼠体内，发现印迹粒子可结合血液中的蜂毒肽，从而可有效地缓解了白鼠的中毒症状。

4.2 蜂毒明肽

蜂毒明肽是蜂毒中的一种主要多肽，占蜂毒干量的3%，由18个氨基酸组成，分子量2035，是蜂毒中各组份中最小的神经毒肽，可透过血脑屏障。以药物分子为模板，利用MIT合成的MIPs与药物间的强相互作用可以延迟药物的释放，还可以通过光照、时间、特定分子的存在或者环境（pH、温度等）改变来调控药物的释放速度。MIPs因制备简单、能够特异性结合/释放药物的特点在药物递送方面具有很大的应用潜力，可应用于靶向给药系统等。表面分子印迹技术合成的MIPs进一步解决了MIPs中药物包埋过深无法释放、因位点不均导致药量不可控等问题，并进一步提高了有效载药量，使其在药物递送领域更具应用前景。Zhang Y等[34]用具有稳定两亲性分子结构的蜂毒明肽为支架、与膜蛋白p32结构类似的多肽为印迹分子、丙烯酰胺为单体，进行了构象表位印迹。因膜蛋白p32在各种肿瘤细胞的表达，所以该印迹模板可以作为靶向识别肿瘤细胞的靶点。聚丙烯酰胺作为光敏试剂的有效载体、聚合前加入甲基蓝，则得到的MIPs在光照后可产生杀伤肿瘤细胞的活性氧，从而进行光动力治疗。这种构象表位印迹策略构建一种新型光控肿瘤靶向药物递送系统。

5 MIT在蜂花粉中的应用

花粉是种子植物特有的结构，直径大小不一，大都在4～200 μm。由于MIPs的孔穴能够适用于不同大小（nm～μm）分析物/印迹分子的选择性识别，所以MIPs能用于免疫球蛋白、胰岛素和花粉等的检测。Lieberzeit PA等[35]在人工材料内含有非共价相互作用的网络这一重要技术能够直接用来在线快速分析纳米到微米级的生物分析物，如免疫球蛋白的小生物分析物作为IM在聚丙烯酰胺表面产生的识别位点能够选择性作用于10 nm大小的蛋白质分子，识别率高到足以区分人、牛和兔的免疫球蛋白。经过修饰的功能化表面材料可以相互作用于直径约10 μm的花粉。桦树花粉与其印迹位点相结合时容易产生Sauerbrey效应，由于聚合材料表面的自由流动性、非印迹材料太小的接触面积导致正频位移。25 Am的桦树花粉在15 μm荨麻花粉的印迹位点上也存在这种效应，因为分析物和聚合物印迹层的费共价键作用太小以至于不能紧密结合这些花粉分析物，所以也产生了正频位移。最后，MIPs材料和相互作用生物分析物的反应孔穴大小可以调整到很高的值，以至于酵母可以作为模板分子固定到其表面。纯水中受困细胞的渗透作用使得聚合物/生物复合材料上的这一结论显示了大量的质量可逆增加。总体而言，该技术可以用于检测酵母细胞的实时状态。Latif U等[36]也认为MIT可以有助于合成如酵母、细菌细胞等较大颗粒的人工受体，以便来检测酵母细胞的生长阶段、区分细菌细胞株。甚至可以帮助人们合成MIPs识别材料以便分析植物花粉，MIPs敏感层的厚度决定了对印迹分析物的可逆包含作用。此外印迹分析物和孔穴间大小匹配和相互作用的测量描述决定着传感器装置的Sauerbrey和non-Sauerbrey作用。Latif U等[37]还探讨了正、负f移位的产生机理，发现正f移位可以用一个其中振动传感器表面耦合到固有的谐振频率颗粒的耦合谐振模型来解释。粒子的质量和接触点粘度/粘结强度决定了它的固有共振频率。强相互作用会使粒子和振动面依次串列在一起，即似Sauerbrey行为；而弱相互作用可以使粒子在表面上自由振动，从而产生正f的变化。在具有弱相互作用的气相和液相中可以观察到正f位移。当芝麻抗体和芝麻蛋白作用时发生负f位移，而和杏仁蛋白作用时能发生正f位移。因此认为正、负f移位甚至可以被用来辨别分析物的选择性的和非选择性的相互作用。从而研制出一种能够分化肿瘤细胞和细胞器的多孔聚合物材料、并设计出了能够选择性识别μm级大小花粉粒的结构化聚合物。

6 MIT在蜂王浆中的应用

Sakamoto Y等[38]以氯霉素为印迹分子，制备了作为固相萃取剂的MIPs，经LC-UV、LC-MS和ELISA方法对清除效率的评估发现其对氯霉素的吸附效果高于传统的反相固相萃取剂，蜂王浆中氯霉素的回收率分别为75%，MIPs萃取剂的使用消除了传统固相萃取剂萃取后存在的干扰峰，采用MIPs能够萃取、清除蜂王浆中的杂质，该方法有望用于检测蜂产品、畜牧产品中的氯霉素残留。

蜂王酸，学名10-羟基-2-癸烯酸(10-Hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA)，是蜂王浆中一种重要的不饱和脂肪酸，具有增强机体免疫力、抗菌、抗癌、抗肿瘤、治疗化学物质所致损伤等多种生理功能。卫莎[39]采用MIT中本体聚合的方法，以蜂王酸为印迹分子，4-乙烯基吡啶为功能单体，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，制备了能够特异性识别蜂王酸的分子印迹聚合物。经过一系列的优化，确定了蜂王酸MIPs的最佳制备条件，并且对聚合物进行了吸附性能表征、红外光谱表征和扫描电镜表征。结果表明，所制备的聚合物具有较快的吸附速率和较高的吸附容量，并通过Scatchard方程对材料结合性能进行分析，计算印迹聚合物的饱和吸附容量Qmax可达858.4 mg·g-1。将制备的蜂王酸分子印迹聚合物作为固相萃取的填充材料，建立固相萃取与高效液相色谱仪联用的方法，检测蜂王浆及其制品中蜂王酸的含量。对固相萃取条件如上样溶液pH、上样速度、淋洗液、洗脱液及其用量进行了优化。所建立方法的检出限(S/N=3)为 0.94 μg·L-1，线性范围为 10 μg·L-1～1000 μg·L-1(R2＞0.99)，九次平行实验的相对标准偏差小于4.54%。选择蜂王浆、蜂王浆冻干粉和蜂王浆口服液进行添加回收实验，蜂王酸的回收率均在86.53～103.28%之间，实验证明了所建方法的准确性和实用性。

7 结论与展望

近年来快速发展的MIT在蜂产品中污染物残留分析方面的应用得到了很多科学家和科研机构的极大重视，尤其是抑菌剂、农药等污染物残留的分析检测和蜂产品中有效物质的富集、分离和检测，但是还存在一些亟待解决的问题。MIPs的制备技术仍需进一步改进，以提高MIPs的选择性识别能力、对印迹分子的结合量和结合位点的均一性；天然的识别系统大都在水溶液中进行，而现阶段的大多数MIPs只能在有机相中聚合、应用，在水等极性溶剂中制备和应用MIPs的问题还尚未完全解决；当前的印迹分子还是以小分子化合物为主，类似蛋白质、花粉和DNA/RNA等生物大分子化合物的印迹仍有待研发；纳米蛋白质MIPs的体内应用还面临很多重要问题，如生物相容性和细胞穿透性等问题；虽然MIT的灵敏度有所提高，但是距离蜂产品实样中农药等污染物残留的快速分析还有许多工作要做；MIPs的商品化应用还处于摸索阶段。尽管MIT在蜂产品中农药等污染物残留分析方面还有许多问题尚未完全解决，但是随着制备方法的改善、实验条件的优化、新分析方法的介入和理论知识的不断发展，MIT在人工抗体等方面将有更加广阔的应用前景和发展潜力。

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