鸡源致病性大肠杆菌的耐药基因PCR检测

2017-01-15马吉军

中兽医学杂志 2017年6期

关键词：琼脂糖致病性类药物

马吉军

(甘肃省临泽县畜牧局，734200)

鸡源致病性大肠杆菌的耐药基因PCR检测

马吉军

(甘肃省临泽县畜牧局，734200)

鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli，E.coli)某些血清型菌株所引起的一类疾病的总称，是危害养鸡业主要细菌性疾病。大肠杆菌血清型众多，且易产生耐药性。鸡致病性大肠杆菌的耐药性与本身携带的耐药基因具有一定的相关性。本实验临床分离5株鸡致病性大肠杆菌，用PCR方法对其四环素类药物的耐药基因tetA和tetB分布进行了检测，结果显示，临床分离5株鸡致病性大肠杆菌均携带检四环素类药物的耐药基因tetA和tetB检出率均为100%，因此，证实了说明临床分离5株鸡致病性大肠杆菌对四环素类药物存在很强的耐药性。

鸡；致病性大肠杆菌；耐药基因；PCR

本试验旨在研究鸡源性大肠杆菌对四环素类药物的耐药性和耐药基因机制的携带情况，讨论二者的相关性，从分子生物学角度,利用PCR技术扩增细菌的保守片段,分析大肠杆菌对四环素类药物产生耐药的原因，为临床上的疾病防治提供了理论支持。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

临床上分离的5株鸡致病性大肠杆菌

1.2 试剂与仪器

革兰氏染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DL2000DNA Marker、琼脂糖、购自TIANGEN生物技术有限公司；Premix Taq（Loading dye mix D334A）购自大连宝生物工程有限公司。FGEN02TD型PCR仪由英国Techne公司生产，DYY-6C型电泳仪由北京六一仪器厂生产，Bio-BEST200E型凝胶成像分析系统由美国西蒙生产。

1.3 相关试剂的配制

1.3.1 5×TBE buffer：Tris 54.0 g，硼酸：27.5 g，20.0 mL 0.5 mol/L EDTA(PH 8.0)定容到 1000 mL，室温保存。

1.3.2 1.5%琼脂糖胶：称取1 g琼脂糖放入三角烧瓶中，量取 5×TBE buffer 20 mL，加入 80 ml双蒸水，5倍稀释成 1×TBE，倒入上述三角烧瓶中，混合均匀，加热使琼脂糖熔化，待冷却至 55℃左右时加 EB 5 μL，倒入凝胶槽冷凝后备用。

1.4 致病性大肠杆菌DNA模板制备

用水煮法提取5株大肠杆菌的DNA组，将5株临床分离的鸡源致病性大肠杆菌分别接种与普通营养肉汤中，置37℃恒温箱震荡培养12 h，5株临床分离的鸡源致病性大肠杆菌取出500μL，6000rpm离心5min，弃去上清，留沉淀，用100μL无菌水重新悬起来，煮沸10min，12000 rpm离心5min，留上清。4℃保存备用。